1. 研究目的与意义
（一）研究内容
本实验将通过构建科学的反应体系，从已知天然化合物库中筛选出能够影响E2酶Ubc12酶活的化合物，希望能通过筛选出的天然来源化合物干预Ubc12调控的Neddylation过程，进而影响Neddylation的生物学功能。具体研究内容如下：
1、纯化实验所用蛋白，设计并构建科学的筛选体系；
2. 文献综述
Ubc12的生物学功能及在肿瘤治疗中的研究进展
摘要：类泛素化修饰Neddylation是与泛素化修饰机制相似的蛋白质翻译后修饰方式之一，类泛素蛋白NEDD8经E1酶活化后，结合到E2酶上，最终连接到E3酶上与E3酶一起识别靶蛋白并对其进行类泛素化修饰。类泛素蛋白连接酶12（Ubc12）是目前已知的关键的NEDD8的E2酶之一，可以特异性介导NEDD8发生Neddylation修饰，而NEDD8被报道在多种肿瘤中过表达，因此以Ubc12为靶点进行干预可能成为治疗肿瘤肿瘤的有效策略。本文对Ubc12的生物学功能及在肿瘤治疗中的研究现状展开综述。
关键词：Ubc12，Neddylation，肿瘤
3. 设计方案和技术路线
研究方案
1、实验方法
1.1纯化蛋白：（1）根据所选蛋白的CDS序列及所需载体的酶切位点设计引物和酶切位点，对已有的少量蛋白进行PCR扩增；（2）通过琼脂糖凝胶分离出扩增的目标DNA分子，用胶回试剂盒进行回收；（3）通过酶切体系酶切所选载体，设置对照组用琼脂糖凝胶验证酶切结果，并对酶切正确的载体进行回收；（4）将目标DNA分子和酶切后的载体进行连接，得到完整质粒后转化、摇菌、小抽验证再送测序，验证质粒构建是否正确。（5）将构好的质粒转化到菌株中，37C摇菌，挑单克隆后再摇菌，然后以1:100的比例接种到大体系；配制LB，灭菌后加入抗生素和上述菌液，摇菌，测OD值达0.6后加入预先摸索出的最佳浓度的IPDG诱导剂诱导；诱导完成后高压破菌，最后使用AKTA pure 25仪器纯化蛋白。（6）大规模纯蛋白之间先通过预实验选择合适的菌株以及IPDG温度、浓度等诱导条件。待选菌株为BL21、DE3；IPDG诱导浓度设置为100μlmol/L、200μlmol/L、400μlmol/L、1000μlmol/L，及未诱导组别，从中筛选最佳浓度；IPDG诱导温度一般从37C及25C中筛选。1.2 Western blot：样本蛋白定量后，加loading分装，95C煮5min，用SDS-PAGE 凝胶分离后转到 PVDF 膜上。根据蛋白条带位置剪膜，用 5% 脱脂牛奶室温下封闭1 h，用TPBS洗膜，4 ℃ 条件下孵育一抗过夜，洗膜，15min洗一次，5min洗两次，室温下孵育对应二抗 1h，再次洗膜，15min洗一次，5min洗两次，在暗室内用ECL曝光液曝光。
4. 工作计划
1、完成文献检索与综述撰写，初步拟定实验方案，准备好实验试剂及耗材。
2、已初步纯化实验过程中所用到的蛋白Ubc12及UBA3。5. 难点与创新点
1、创新性的用天然来源化合物来干预Ubc12的酶活，进而影响Neddylation的修饰过程及其生物学功能；
2、创新性的从构建筛选体系的角度研究能够干预Ubc12酶活的天然来源化合物；以上是毕业论文开题报告，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
