1. 研究目的与意义
丹参（Savia miltiorrhiza Bunge），始载于《神农本草经》，为唇形科（Labiatae）鼠尾草属（Salbvia L）植物，是药典中药丹参的正品来源，药用历史悠久，其干燥根及根茎具有祛癖止痛、活血通经、凉血消痈的功效。丹参酮类成分是丹参治疗疾病的主要活性成分之一，具有多种药理活性，研究表明丹参酮 I 具有扩冠状动脉、保护心肌缺血损伤等生物活性，丹参酮 IIA 具有较强的心血管活性作用，丹参酮 I、丹参酮 IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮 I 和丹参新醌甲等还具有抗菌活性，对金黄色葡萄球菌及其耐药菌株具有较强的抑菌作用。丹参是我国大宗药材之一，复方丹参滴丸、通心络等丹参产品临床需求不断增大，丹参可持续发展和利用面临巨大的压力，通过栽培种植的方式获得有效成分周期长、效率低、生态压力大，而通过化学方法合成丹参酮，成本过高，过程繁琐，也对环境造成难以估计的污染。因此依托生物合成途径解析，利用现代基因工程技术研究丹参酮类化合物生物合成途径中的关键酶是提高丹参药用活性成分的含量和解决丹参药源问题的有效方法。本次实习内容，在前期的基础上，以加诱导子处理过的丹参毛状根为材料，根据转录组数据信息筛选可能参与丹参酮化合物生物合成的基因片段，设计全长引物，采用 PCR 方法从丹参酮毛状根中首次克隆得到 isotig09665的 cDNA 全长序列，为之后的丹参酮生物合成功能基因筛选提供候选基因。
2. 文献综述
药用植物功能基因研究技术与方法（综述）
摘 要：药用植物功能基因研究主要是探究中药活性成分的功能基因及其表达规律，以期为中药有效成分关键代谢途径和其关键调控因子研究打下基础。本文介绍了药用植物功能基因研究中相应的生物信息学分析、体内外功能验证等常用的技术与方法。
3. 设计方案和技术路线
本次实验从 2017.1.5 开始，至 2016.6.11.结束，实习总时间 22 周。
在此期间，首先进行前期准备工作，主要包括查阅文献，学习、了解丹参酮生物合成途径研究进展以及药用植物功能基因研究技术与方法。
实验设计主要步骤为：1. 筛选差异表达的基因片段，利用 KD 酶使用 PCR 技术扩增基因；2. 琼脂糖凝胶电泳检测目标片段；3. 构入大肠杆菌载体，并进行阳性检测；4. PCR 产物测序；5. 根据测序结果对基因进行功能预测和分析；6．得到完整基因，用于构建酵母表达载体
4. 工作计划
2022.01.04- 2022.01.25：查阅文献，撰写综述。
2022.02.08- 2022.03.08：进行基因扩增、PCR 产物测序、琼脂糖凝胶电泳检测、原核表达、真核表达等实验内容。
5. 难点与创新点
利用比较转录组学筛选得到了与丹参酮积累相关的 P450 基因，采用 PCR方法从丹参酮毛状根中首次克隆得到 isotig09665 的 cDNA 全长序列，为之后的丹参酮生物合成功能基因筛选提供候选基因。
该基因的克隆一方面为研究其在丹参酮生物合成途径中的功能提供基础，另一方面也丰富了丹参酮生物合成途径的候选 P450 基因库。
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