白附子凝集素致炎机制研究开题报告

1. 研究目的与意义

天南星科有毒中药白附子（Typhonium giganteum Engl.）被历代本草文献记载为有毒，临床误服生品或鲜品均出现强烈的刺激性毒性，表现为口唇刺痛肿胀、咽喉肿痛甚或失音、流涎、呼吸困难甚至窒息死亡，与皮肤接触会出现瘙痒、湿疹，严重的可引起接触性皮炎。

实验室前期研究表明，天南星科有毒中药其毒性成分是具特殊晶体结构的针晶，被称为毒针晶，毒针晶由草酸钙、蛋白、多糖等物质组成，并发现毒针晶带有的毒蛋白是其中的凝集素蛋白，研究发现凝集素蛋白可通过巨噬细胞介导，促进中性粒细胞迁移聚集，并可刺激巨噬细胞释放大量炎症因子，表明凝集素蛋白具有显著的促炎作用。

细胞中活性氧ROS是炎症信号通路的关键信号分子，其可以直接激活炎症信号通路NF-κB，进而导致炎症因子的大量释放。故猜测天南星科有毒中药白附子凝集素其导致的NF-κB炎症信号通路的激活可能与ROS的介导相关。ROS的生成与线粒体膜电位以及胞内游离Ca² 水平相关。线粒体作为细胞内钙库，其内Ca² 水平的超载导致线粒体PT孔(线粒体上的一种通透性转变孔)的开放，线粒体膜电位降低，Ca² 从钙库释放，胞内游离Ca² 水平上升同时会促进ROS大量生成，二者相互促进。为进一步研究白附子凝集素的致炎机制，本文采用流式细胞术、Western Blot等技术，以阐明天南星科有毒中药白附子凝集素的致炎作用机制。

2. 文献综述

天南星科有毒中药毒性及炮制研究进展

13中药制药 张志远 046213141

摘要：天南星科许多植物被记载为有毒，误服或接触此类植物后，会产生强烈的刺激性毒性，临床上通常以制品入药。天南星科有毒中药炮制前后的成分和毒性均有变化，现对其炮制工艺及炮制前后毒性、化学成分变化做一综述。

关键词：半夏；天南星；白附子；炮制；毒性；成分变化

天南星科中药半夏（Pinellia ternata (Thunb.)Breit.）、掌叶半夏（Pinellia pedatisecta Schott.）、天南星（Arisaema amurense Maxim.）及白附子（Typhonium giganteum Engl.）均被历代本草文献记载为有毒，临床误服均出现口唇肿痛、失音、流涎、痉挛、呼吸困难，甚至窒息死亡，与皮肤接触会出现瘙痒、湿疹，严重的可引起接触性皮炎，临床上通常以制品入药。天南星科有毒中药炮制前后其化学成分、药理作用、毒性大小均有变化，现就其炮制方法及工艺、化学成分变化、毒性变化进行综述。

1.天南星科有毒中药的炮制方法和工艺

1.1天南星科有毒中药炮制的历史沿革

1.2天南星科有毒中药炮制工艺的现代研究

1.2.1 半夏

2015版药典记载的半夏炮制品有清半夏、姜半夏和法半夏，所用辅料有白矾、生姜、甘草、生石灰等。半夏的炮制方法很多，工艺悬殊，不同的炮制工艺对半夏的化学成分和药理作用产生一定的差异。王潮奎^[1]等研究了半夏炮制过程中加矾量及加热方式与所炮制饮片的质量和毒性的关系，并发现半夏加热加压30min和经8%白矾溶液浸制均可使半夏的麻辣消除，水浸出物量增加。吴皓^[2]等以药典规定的明矾浓度和碱液浓度浸泡生半夏，结果发现8%明矾水或pH>12以上的碱水炮制可以使生半夏药材中具有强刺激性成分草酸钙针晶的针形晶体破坏，含量降低，刺激性毒性降低。梁君^[3]等对姜半夏产地加工炮制一体化方法和工艺进行客观评价和优化，优选出的炮制方法及工艺为每100 g鲜半夏，加白矾10g、生姜（捣烂）20 g，共同加热至沸腾30min后浸泡3d，再以120℃加压蒸煮40 min，清水洗净，晾半干，切片后干燥，此种方法能降低刺激性毒性成分草酸钙针晶质量分数，提高饮片质量。张琳^[4]等用正交试验设计对法半夏的炮制工艺进行质量评价和优化，优选出的最佳工艺为在30℃下，每100 g半夏，用生石灰10 g、甘草15 g，浸泡48 h，此种工艺达到了降低半夏刺激性毒性的炮制目的，同药典法比较明确了炮制时间和炮制温度，显著缩短了炮制时间。

此外，半夏的炮制品还有京半夏、熟半夏等，其在《中国药典》中没有记载，但在相关省市有所应用，王贵英^[5]介绍了京半夏的炮制辅料是明矾与甘草煎液、石灰，炮制工艺包括水洗、水浸泡、晒干，加石灰甘草液制，烘干。赵典刚^[6]遴选了半夏的最佳熟法炮制工艺，确定最佳炮制工艺为温度115℃、时间120min、加水量25倍，压力 8010⁴Pa。

1.2.2天南星

2015版药典记载的天南星炮制品为制天南星，每100kg天南星，用生姜、白矾各12.5kg。皮晓霞^[7]等对天南星炮制过程中的加热时间和加矾量与所炮制的饮片的质量和毒性关系作了实验探讨，实验结果表明，天南星生片经8%白矾溶液闷润后加热加压60min，所得的天南星炮制饮片不但麻醉性消除，而且水浸出物量大大提高。杨中林^[8]等利用正交实验设计，以口尝麻辣味为指标，筛选天南星（虎掌）最佳炮制条件，实验结果表明天南星的最佳炮制条件为：加白矾12.5%、加热100℃、不水漂、加热4h，其中加热时间为关键因子。韦英杰^[9]等以口尝麻辣味为指标，采用正交实验设计，优选出东北南星炮制的最佳工艺：东北南星生品100 kg，清水漂8d（每天换水2~3次），加入到适量水煮沸的生姜片和白矾溶液中（每100 kg生品用生姜12.5 kg，白矾6 kg），煮2 h，取出，晾至4~6成干，切薄片晾干。此外，天南星的一种发酵制剂胆南星，是用制天南星或天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经加工而成，或用生天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成。马凤友^[10]对胆南星的混合制法和历时3年的发酵制法进行了比较，认为发酵法的药效更为显著并可使胆南星色渐转黑，胆味渐消。唐思园^[11]研究发现在37℃干燥条件下，对以牛胆粉为原料的胆南星进行发酵，可以得到含有较高含量胆酸类物质的胆南星发酵产物。

1.2.3白附子

2015版药典记载的白附子炮制品为制白附子，每100kg白附子，用生姜、白矾各12.5kg。张振凌^[12]等优选了白附子趁鲜加工炮制的方法和工艺条件，优选出的炮制方法和工艺为：每100kg鲜白附子，加白矾6kg、生姜6kg，加热至沸腾30min后继续泡润48h，再以120℃加压蒸煮30h，切片后干燥，这种炮制工艺能在降低刺激性和毒性成分含量、保留有效成分的同时，减少加工与炮制工艺的重复，节省了人力物力。谢华^[13]等发现白矾复制法能够降低白附子中草酸钙含量。赵素霞^[14]等通过正交试验优选白附子炮制工艺并确定炮制工艺为6%白矾浸泡，115℃加压煎煮30min。

2.天南星科有毒中药的毒性作用研究

天南星科中药半夏、掌叶半夏、天南星及白附子均被历代本草文献记载为有毒，毒理学研究表明，半夏生品混悬液能使家鸽呕吐^[15]，腹腔注射可使小鼠腹腔毛细血管通透性增强并使渗出液中炎症介质PGE2含量增加，可强烈刺激家兔眼结膜，产生炎症反应^[16-20]。文献研究表明，半夏生品呈现极显著的黏膜刺激作用，半夏的毒性是一种接触性刺激性毒性。

上世纪90年代末，吴皓等^[21]提出半夏中所含的针晶可能是半夏的刺激性成分之一。认为半夏中的针晶具有特殊的晶体结构，大量的、极细长并质地坚硬的针状样晶体可刺入粘膜细胞，导致细胞破损，产生大量的炎症介质，从而引起刺激疼痛感并产生炎症反应，并认为半夏针晶的晶形、含量与半夏的刺激性毒性相关，炮制后的半夏中的针晶体，晶形发生变化，含量急剧下降，刺激性亦明显减弱。2006年钟凌云等证实半夏的刺激性毒性成分确实为半夏中的针晶^[22]。天南星科其他有毒中药掌叶半夏、天南星、禹白附、水半夏也表现出与半夏极其相似的毒性，2008年吴皓等^[23]报道生水半夏、生白附子、生天南星均含有与半夏中的毒针晶的晶体结构及功能极其相似的针晶体，其毒针晶可产生强烈的刺激性毒性，各药材中提取的针晶与各药材生品混悬液在针晶含量相同的条件下，对家兔的眼刺激性作用基本相同，同时针晶浓度与家兔眼刺激程度呈现确切的量效关系，研究结果表明毒针晶是天南星科有毒中药中所含的共有刺激性毒性成分。有研究认为天南星科植物产生刺激性作用是植物毒性蛋白的化学伤害与草酸钙针晶的机械性伤害共同引起^[24]。吴皓等发现毒针晶中提取所得的蛋白类物质可以加重破损皮肤的炎症反应，认为针晶的毒性是由针晶与针晶蛋白的共同作用导致^[25]，并且发现其毒性作用与巨噬细胞密切相关^[26-28]。 Hsueh等^[24]认为Dieffenbachia，包括D. amoena和D. sequine都含有草酸钙针晶和蛋白酶类，可诱导病理症状产生。

V Beasley认为在天南星科许多植物中都含有草酸钙针晶，它们包括花叶万年青属植物Dieffenbachia spp.、彩叶芋属植物Xanthosoma spp.、龟背竹属植物Monstera spp.、蔓绿绒属植物Philodendron spp.、五彩芋属植物Caladium spp.（如Caladium）等。植物中的针晶使其产生强烈的刺激作用^[29]。Hsueh 等认为Dieffenbachia属以及天南星科的其他植物包括Arisaema、Pinellia、Colocasia和Philodendron等种属引起的人眼伤害是由于植物中所含有的草酸钙针晶刺入眼睛引起角膜结膜炎^[24]。Lin等指出天南星科植物中的草酸钙针晶能引起口腔和黏膜的炎症^[30]。

3.天南星科有毒中药炮制前后化学成分变化研究

3.1生物碱类

天南星科有毒中药中生物碱类成分是药材主要成分之一。吴皓^[31]等研究半夏姜制对麻黄碱含量的影响，检测发现半夏中含有的麻黄碱成分含量为0.00344%，经炮制后，半夏5种炮制品中麻黄碱含量的顺序依次为：姜矾半夏＞生半夏＞姜浸半夏＞姜煮半夏＞矾浸半夏，矾水浸和单纯加热对麻黄碱的含量影响最大。张跃进^[16]等对半夏采用不同的方法进行炮制，发现在生物碱方面，生半夏>法半夏>姜半夏、清半夏，姜半夏和清半夏没有显著性差异。竹小全^[32]探讨了不同炮制方法对半夏中总生物碱含量的影响，结果发现姜矾制半夏中总生物碱含量最高。吴鲁东^[33]等研究炮制过程中天南星总生物碱含量的动态变化，发现总生物碱在炮制过程中含量逐步降低。

3.2氨基酸类

天南星科有毒中药在炮制前后其氨基酸类成分的含量会产生变化。薛建海^[34]等研究发现半夏的炮制对氨基酸的含量影响较大，半夏及其炮制品中氨基酸的含量分别为清半夏>姜半夏>生半夏>法半夏。张跃进^[31]等对半夏采用不同的方法进行炮制，发现在蛋白质含量方面，生半夏>法半夏>清半夏>姜半夏。刘美丽^[35]等对天南星及其炮制品的氨基酸含量进行测定，发现总氨基酸的含量生品高于炮制品。张振凌^[36]等比较了不同炮制方法对禹白附中17种氨基酸含量的影响，结果显示不同批次生禹白附中氨基酸含量有所差异，但含量趋势基本相同，其中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸的含量最高，蛋氨酸、胱氨酸的含量最低。总氨基酸含量：生禹白附>加压法>河南法>药典法。

3.3苷类

刘福燕^[22]等对生品半夏中苷类成分进行测定，结果显示尿嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷总含量的平均值为0.03%。张跃进^[31]等对半夏采用不同的方法进行炮制，发现在鸟苷含量方面，生半夏>清半夏>姜半夏>法半夏；吴皓^[37-39]等对半夏不同炮制品中的鸟苷含量进行测定，结果表明清半夏鸟苷的含量与生品均有不同幅度降低。李雪玲^[40]等研究发现炮制半夏中鸟嘌呤核苷含量较生品均有不同幅度下降。

3.4 草酸钙针晶

余悦^[41]等研究炮制对天南星科毒性中药中草酸钙针晶的影响，运用光学显微镜对炮制前后药材中针晶束的形态进行观察，显微观察发现天南星科毒性中药生品中的针晶束尖端明显，而制品中既有尖端明显的针晶束也有两端钝圆的针晶束，表明天南星科毒性中药经炮制后草酸钙针晶形态发生了变化。唐力英^[42]等认为天南星针晶是产生刺激性毒性的主要物质基础，天南星针晶的刺激毒性与其结构形态有关，明矾炮制减毒的机制可能是其Al³ 加速破坏了草酸钙针晶的形态。研究发现半夏醇制、矾致能够减毒^[43-46]。杨伟鹏^[47]等考察以猪胆汁、牛胆汁作为辅料炮制天南星是否具有减毒增（存）效作用，结果表明以猪胆汁、牛胆汁作为辅料炮制天南星能够起到减毒存效的作用。

4.结语

天南星科的中药在临床应用已有两千多年的历史，在多种疾病的治疗中作用显著，但其毒性仍不可小视。天南星科有毒中药的炮制品众多，多是采用白矾、石灰等辅料，同时以加热加压等方式进行炮制，以降低其毒性。炮制方法不同，临床疗效也不尽相同，从目前的炮制研究发现，天南星科有毒中药的炮制工艺在传统的炮制基础上正向规范化方向发展，疗效和毒性也有了更好的保障和控制。但是天南星科有毒中药在炮制过程中其毒性和疗效产生变化的机制还未见报道，其具体的作用机制还有待进一步研究。

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3. 设计方案和技术路线

4. 工作计划

2017.02-2017.03 查阅资料，并提取分离纯化白附子凝集素蛋白

2017.03-2017.04 研究白附子凝集素蛋白对巨噬细胞氧化应激ROS水平的变化，以及对线粒体膜电位及胞内游离钙离子的变化。

2017.04-2017.05研究白附子凝集素蛋白对炎症信号通路NF-κB，以及炎症因子的作用。整理实验数据，完善论文。

5. 难点与创新点

1、本课题首次从细胞氧化应激与炎症的相关性角度，采用体外模型，研究天南星科有毒中药白附子凝集素蛋白的致炎机制，研究思路具有创新性。

2、本课题采用AKTA蛋白纯化技术、流式细胞术、Western Blot以及Elisa等技术进行研究，研究方法具有创新性。

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