1. 研究目的与意义
一、研究内容
1）经方桂枝茯苓丸的免疫调节机制：分别从体液免疫和细胞免疫两个角度去探讨，首先测定药物处理和对照组大鼠外周血液中免疫球蛋白IgG, IgA, IgM含量的变化，其次考察大鼠脾脏内CD4 T淋巴细胞、腹腔液中巨噬细胞、IL-1、TNF分泌水平。
2）经方桂枝茯苓丸对异位内膜组织中MCP-1、ICAM-1、FN、TGF-β1蛋白和mRNA的表达影响。
2. 文献综述
子宫内膜异位症发病机制研究进展
张婷婷(综述)
摘 要：子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是一种妇科常见病、多发病、疑难病症。EMs多发生于40岁以上的经产妇，发病率高达50%。EMs的病因和发病机制复杂，除传统的子宫内膜种植学说外，近年来，从干细胞学说、免疫学、中医病理病机等角度对EMs的研究逐渐深入。对EMs发病机制的各种研究进行综述，从而有助于从更新的角度了解EMs的发生、发展过程。
3. 设计方案和技术路线
一、研究方案
1）药物制备：按《金匮》处方组成：桂枝9克、茯苓9克、牡丹（去心）9克、桃仁（去皮尖，熬）、芍药9克。桂枝、牡丹皮加10倍量水提取挥发油，挥发油用β-环糊精包裹，包结物于40℃干燥，研碎备用；药材过滤，滤液另器存放，药渣和药液连同茯苓、桃仁、芍药等三味加水煎煮二次，每次加药材10倍量水，提取1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述药液合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25（80℃）的浸膏，与上述挥发油用β-环糊精包结物混匀，置真空干燥箱中，于80-85℃真空干燥，粉碎，加入适量辅料，制粒，包装，即得。
2）动物模型制作：造模组根据杨萍等的方法改进制作EMs动物模型。大鼠皮肤常规消毒后，下腹部正中切口长约3 cm，进腹后在膀胱背侧找到子宫。游离左侧子宫，近端离左子宫角l cm 处结扎，远端离卵巢l cm处结扎。将切下的子宫组织放在盛有无菌生理盐水的培养皿中，纵行解剖开子宫段，剪取3 mm5 mm的子宫内膜组织（含子宫肌层）一块。在腹壁切口右侧从腹肌与皮下筋膜层之间打隧道，以正好能置入子宫片为宜，再取子宫内膜组织一块平整的置人右侧隧道底部，使内膜面紧贴腹肌，常规关腹。第21天用3.5%的戊巴比妥钠麻醉（10ml/kg），麻醉后，固定大鼠于超净工作台上，腹部剃毛，皮肤常规消毒，下腹部正中切口长约3cm，逐层打开腹腔，观察模型大鼠的异位内膜形态学变化，并用游标卡尺测量异位内膜组织体积，体积增大≥8mm3，出现液体积聚，呈隆起透亮的小囊状，即造模成功。
3）RT-PCR检测异位内膜组织中MCP-1和ICAM-1 mRNA的表达：Trizol提取所取各组内膜组织总RNA，以总RNA为模板，使用随机引物Random6 mers合成cDNA。以逆转录形成的cDNA为模板，进行PCR，反应条件为：94℃，3 min；94℃，45s；50℃，45 s；72℃，1 min；72℃延伸7 min。30个循环。PCR 产物经1％琼脂糖凝胶电泳，BIO-RAD凝胶成像系统摄像。
4）免疫组化检测内膜组织中MCP-1和ICAM-1的分布和表达：各组所取内膜组织进行脱水，包埋，切片。脱蜡和水化后置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇分别浸泡5分钟。不锈钢压力锅中加热修复抗原1~2分钟。3% H2O2室温孵育10min消除内源性过氧化物酶的活性, PBS洗3min x 3。10% 正常山羊血清室温封闭10 min，倾去血清，勿洗, 滴加一抗， 4℃过夜，PBS洗3 min x 3。加适量生物素标记兔抗羊IgG二抗，37℃孵育30 min，PBS洗3 min x 3。滴加2滴新配的DAB显色液，显微镜观察3-10min，阳性显色即为标色。蒸馏水充分冲洗，苏木素轻度复染，脱水，透明，树胶封片。镜下观察拍照。
5）Western blot检测内膜细胞survivin、Bcl-2、Bax、COX-2的表达：SDS-PAGE凝胶经转移缓冲液（25mmol/L Tris碱、192mmol/L 甘氨酸、20%甲醇）浸泡10-20min。按照多孔垫料、3张滤纸、凝胶、NC膜、3张滤纸、多孔垫料的顺序组装盒式转移塔，并将其以NC膜向阳极的方向装入转移装置。于4℃持续搅拌条件下，恒流电转移1～2h。用丽春红染液对滤膜进行染色，标记笔标记蛋白分子量标准各条带所在位置，再用去离子水洗去丽春红。滤膜经5%脱脂奶粉于室温封闭1h；与稀释于5%脱脂奶粉的一抗于4℃孵育过夜，TBST（10mmol/L Tris 碱、150mmol/L氯化钠、0.05% Tween 20、pH8.0）摇洗4次15min。与稀释于5%脱脂奶粉的HRP标记的山羊抗小鼠IgG于室温孵育1.5h，TBST摇洗4次15min。以ECL进行显色。
二、技术路线
4. 工作计划
2022.02.26-2022.03.03 查阅并整理文献资料
2022.03.04-2022.03.09 完成开题报告
2022.03.12-2022.05.31 进行课题实验
5. 难点与创新点
1、本课题是首次尝试利用现代生命科学研究的思路和方法研究经方桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症的免疫调节机制。通过本课题的研究，可能揭示该胶囊可降调异位组织中MCP-1、ICAM-1、FN、TGF-β1、survivin及其mRNA的表达水平，显示其多靶点的免疫预防及治疗作用，体现了中药经方桂枝茯苓丸对子宫内膜异位症的非线性的整体调节作用。
2、经方桂枝茯苓丸是治疗子宫内膜异位症的复方中药，在国内已经被广泛临床使用，但由于中药研制的思路方法与国际上西药研制有相当的不同，比如中药成分复杂、机制不清楚，若想走出国门，为国际医学专家和患者所接受，利用现代生命科学研究的思路和方法进行经方桂枝茯苓丸治疗宫内膜异位症的机制探讨就显得非常紧迫，同时，本课题的实施，在国际期刊发表相关机制的研究论文，也是宣传经方桂枝茯苓丸在子宫内膜异位症等疾病良好治疗作用的手段之一，为经方桂枝茯苓丸进行深度开发和推广提供理论支撑，给企业可带来潜在的社会效益和经济效益。
3、本项目的顺利实施为经方桂枝茯苓丸治疗其它妇科疾病分子机制的探讨提供示范作用，并为设计新的中药复方提供了理论依据和技术支持。以上是毕业论文开题报告，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
