1. 研究目的与意义
内容：参考孟鲁司特钠钠颗粒进口注册质量标准（JX20040261）中有关物质检查方法和孟鲁司特钠片质量标准（YBH06562006)中有关物质检查方法，对两个方法分别进行方法学验证，并对测定结果进行比较，最终确定本品的有关物质检查方法。
意义：由于孟鲁司特在抗炎、免疫等诸多方面有重要的应用价值，可以用来治疗慢性鼻炎，还口用来防治儿童和青少年的经常性偏头痛或慢性日间头痛等，因其优良的疗效和广阔的市场前景，开展孟鲁司特制剂的开发研究，特别是原有优良制剂的仿制和改进，对形成具有自主知识产权的药品具有重要意义，其中优良的有关物质检查方法，确保有关物质检查准确、可控显得尤为重要。
2. 文献综述
孟鲁斯特纳有关物质方法学验证
摘要 目的:建立一种有效测定孟鲁司特钠中有关物质的高效液相谱法。方法:采用苯基柱(250mm 4.6mm,5μm)；流动相A为 0.2%三氟乙酸水溶液；流动相B为乙腈，梯度洗脱，柱温为50℃；波长为255nm；流速为1.5ml/min；进样体积为20μl。预期结果：孟鲁司特钠颗粒的各个杂质在此色谱条件下能得到有效分离，该方法可用于孟鲁司特钠颗粒的有关物质检查与质量控制。
关键词 孟鲁司特钠，有关物质方法学，高效液相色谱法
孟鲁司特钠(Montelukast Sodium)是新一代非甾体抗炎药物，为一种选择性白三烯受体拮抗剂[1]。本品对CysLT1受体有高度的亲和性和选择性，阻断白三烯的致炎作用控制哮喘发作而无任何受体激动活性，其治疗儿童哮喘的临床有效性和安全性已得到证实。目前临床上所用的剂型大多为片剂，但目前为止尚无制剂的质量标准。孟鲁司特钠稳定性较差，对强酸、光照不稳定、易分解，遇氧化剂易氧化，原料药的合成及制剂生产过程中易产生多种有关物质，这很可能与孟鲁司特的不良反应有关（如药物性肝炎、致腹泻、致头痛、致排尿困难、致遗尿 致膝关节痛、致精神异常等）[2].。因此，建立孟鲁司特钠有关物质测定方法来控制其质量很有必要。本文主要通过参考的药典方法、文献报道以及他人实验探索的一些方法进行对比分析，建立孟鲁司特钠颗粒有关物质检查的高效液相色谱法，并希望达到预期的结果。
1.有关物质方法学的色谱条件及比较
通过对杂质结构理化性质和现有质量标准要求的研究，决定参考孟鲁司特钠颗粒进口注册质量标准（JX20040261）中有关物质检查方法中有关物质检查方法（方法1）进行有关方法学研究，同时采用孟鲁司特钠片质量标YBH06562006)中有关物质检查方法对方法（1）进行验证性研究，对结果进行比较分析，从而确定本品的检查方法。同时又通过查阅文献以及笔者实验探索的一些方法进行参考，旨在建立有效的孟鲁司特钠有关物质检查的高效液相色谱法。
1.1有关物质方法（参考）方法学条件
(根据国家食品药品监督管理局进口药品注册标准，JX20100276)色谱:Agilent ZOＲBAX XDB-C18(4.6mm 250mm，5μm)；柱温：40℃；流速：1.2mL.min-1检测波长:280nm；进样体积：20μL；流动相A：磷酸缓冲液(取磷酸1.5mL，溶于750mL水中，用三乙胺调节pH值为7.5 0.05)- 四氢呋喃(75：25)，流动相 B：甲醇-四氢呋喃(90∶10)。采用线性梯度洗脱。
1.2有关物质方法（参考）方法学条件
(根据国家孟鲁司特钠片剂进口质量标准，H20020544)：色谱柱：PhenomenexLuna phenyl-Hexyl(4.6mm250mm，5μm)；柱温：50℃；流速：1.5mL/min；检测波长：255nm；进样体积:20μL；流动相 A：0.2%三氟乙酸水溶液，流动相B:甲醇-乙腈(60∶40)。采用线性梯度洗脱。
1.3有关物质方法（参考）方法学条件
(根据孟鲁司特钠原料药美国药典标准):色谱柱:AgilentZOBAXSB-PHENYL4.6mm50mm，1.8μm)；柱温：30℃；流速:1.2mL .min-1；检测长:238nm；进样体积：20μL；流动相A:0.15%三氟乙酸水溶液，流动相B：0.15%三氟乙酸-乙腈溶液。采用线性梯度洗脱[7]。
1.4有关物质方法（参考）方法学条件
色谱柱：AgilentZOＲBAXSB-PHENYL(4.6mm50mm,1.8μm)；柱温:30℃流速：1.2mL.min/L检测波长:238nm；进样体积：20μL；流动相A：20mmol/LNa2HPO4水溶液用磷酸调pH至 5.7，流动相B：乙腈。采用线性梯度洗脱[9]。
1.5有关物质方法（1）方法学条件
孟鲁司特钠颗粒进口注册质量标准（JX20040261）中色谱条件的规定为：色谱柱苯基柱（苯基键合硅胶为填充剂，长250mm，内径5mm，填料粒径5μm）；流动相A：0.2%的三氟乙酸水溶液流动相，B：甲醇乙腈（60:40），梯度洗脱，检测波长255nm。
1.6有关物质方法（2）方法学条件
孟鲁司特钠片质量标准（YBH06562006）中色谱条件的规定为：色谱柱：C18柱（十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，长250mm，内径5mm，填料粒径5μm）；流动相：25mmol/L醋酸铵乙腈（25:75，按0.02%加入十二烷基硫酸钠，用氨水调pH值为8.0）；等度洗脱，检测波长270nm。
在此着重比较有关物质方法（1）和有关物质方法（2）色谱条件差异，其余色谱条件仅在实际操作中作为优化色谱条件的参考。比较以上色谱条件的差异，从水相系统的差异分析，半数方法选择用三氟乙酸溶液作为水相，其余方法水相则加入缓冲盐溶液，加入缓冲盐能增加系统的洗脱能力，但从孟司斯特钠与杂质的结构分析，有机相的比例对本品影响更大，水相系统影响较小；从pH值差异分析，孟鲁司特钠的等电点pKa为6.50.8。故方法（2)系统pH值为8.0比较接近等电点，对峰型等各方面有一定的影响；从波长差异分析，两个系统因pH值得不同，可能对主峰与杂质的最大吸收波长有影响。综合分析色谱条件的差异，选择方法（1）作为本品有关物质的测定条件，将方法（2）作为确证性方法进行比较研究。
2.杂质相关内容
参考孟鲁司特那颗粒质量标准（JX20040261)中有关物质检查方法和孟鲁司特钠片质量标准（YBH06562006）中有关物质检查方法，控制的已知杂质有孟鲁司特亚砜、孟鲁司特酮基甲醇、孟鲁司特甲基乙烯。孟鲁司特钠稳定性较差，对强酸、光照不稳定、易分解，遇氧化剂易氧化[3]，在原料药的合成及制剂生产过程中易产生多种有关物质，在酸、碱、光照条件下有明显的降解物，高温、高湿条件下较为稳定，氧化条件主要表现为亚砜降解明显，因此药物保存时要注意避光。
3.有关物质方法学验证内容
使用孟鲁司特那、孟鲁司特亚砜、孟鲁司特酮基甲醇、孟鲁司特甲基乙烯对照品溶液、混合对照品溶液、供试品溶液、空白辅料溶液进行检测波长选择试验、流动相选择试验等对色谱条件进行优化，并确定最终的条件。使用优化后的色谱条件进行验证试验，包括辅料干扰试验、专属性试验、溶液稳定性试验、系统适用性试验、低浓度标准曲线、检测限与定量限、重复性试验、中间精密度试验、耐用性试验等。
4.有关物质标准及控制限度
目前各国药典对孟鲁司特钠原料药的杂质均有严格的规定，但临床上所用的剂型大多为片剂和颗粒剂，目前为止制剂的质量标准很少[4]，参照参考孟鲁司特钠颗粒进口注册质量标准（JX20040261）中有关物质检查方法和孟鲁司特钠片质量标准（YBH06562006)中有关物质检查方法进行有关物质检查与质量控制。各标准中对有关物质的测定条件即限度要求见表1
孟鲁司特钠相关标准及限度要求
名称 | 标准来源 | 色谱条件 | 控制 |
颗粒剂 | 孟鲁司特钠颗粒进口注册质量标准（JX20040261） | 色谱柱：苯基柱（苯基键合硅胶为填充剂）2 流动相A：0.2%的三氟乙酸水溶液 流动相B：甲醇乙腈（60:40） 梯度洗脱，检测波长：255nm | 孟鲁司特亚砜≤1.0%；S-异构体≤0.1%；孟鲁司特酮基甲醇≤0.1%；其他最大单杂≤0.1%；总杂≤1.2% |
片剂 | 孟鲁司特钠片质量标准（YBH06562006) | 色谱柱：C18柱（十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂） 流动相：25mmol/L醋酸铵乙腈（25:75，按0.02%加入十二烷基硫酸钠，用氨水调pH值为8.0） 等度洗脱，检测波长270nm | 总杂≤1.5% |
虽然孟鲁司特钠的不良反应机理尚不清楚[8]，我觉得除了与受体选择性较强，（一种强效选择性 Cys-LT1Rs拮抗剂）[6]导致其他受体的增敏或其他通路的开放外，在生产和储存中产生的杂质（如孟鲁司特亚砜、孟鲁司特酮基甲醇、孟鲁司特甲基乙烯)[5]很有可能导致毒副作用，需进一步研究。建立有效的孟鲁司特钠有关物质测定方法来控制其质量很有必要。
5.结语
使用高效液相色谱仪进行孟鲁司特那有关物质测定是比有效的方法，在孟鲁司特那颗粒质量标准（JX20040261)和孟鲁司特钠片质量标（YBH06562006）中均有有关物质检查方法，在一些文献中也有笔者实验探索的一些方法，但这些方法均无法分离检测S-异构体[10]，如果实验过程中能摸索到在保证有效分离主峰和杂质的前提下，使S-异构体也能达到分离要求的检测方法，将对孟鲁司特那制剂的分析检测和质量控制具有一定的积极意义。
参考文献
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[3]黄涛.HPLC 外标法测定孟鲁司特钠的有关物质.(天津市儿童医院,天津300074)
[4]沈卫阳,胡陈夷,操敏,林淑贞,陈永辉(中国药科大学理学院,药物质量与安全预警教育部重点实验室 南京 210009).
[5]李婷婷,李洁,郑子栋.HPLC法测定孟鲁司特钠咀嚼片的含量及有关物质[J].中国药房2013年第24卷第5期.
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[9]谢沐风.如何建立高效液相色谱法测定有关物质的方法［J］中国医药工业杂2007,38(1):45
[10]美国FDA发布有关孟鲁司特的安全性评估信息 [J].中国执业药师2009 ,6 (4 ):13-14.
3. 设计方案和技术路线
研究方案:①参考现有关于有关物质检查的标准，拟定有关物质方法学。
②仪器与试剂、试药、对照品的确认和选购
③参照标准进行有关物质方法学验证，优化并确定最佳有关物质方
4. 工作计划
第一阶段：2022.1.5-2022.3.1 查阅资料，参考药典，思路形成
第二阶段：2022.3.1-2022.4.10 实验仪器、试剂、对照品准备，初步实验，
条件摸索。
5. 难点与创新点
虽然孟鲁司特钠进口注册质量标准（JX20040261)和孟鲁斯特钠片质量标准（YBH06562006）中均有有关物质检查方法，但在实际应用中仍有缺陷，需要进一步改进和优化（如按孟鲁斯特钠进口注册质量标准（JX20040261)中有关物质的色谱条件，孟鲁司特顺式异构体峰与主峰重叠在一起，无法分离）因此为了更好的分离检测杂质，需对原色谱系统进行优化（如改变流动相比例、更换不同型号的色谱柱、调节流速），确定最佳色谱系统，使已知杂质与主峰能完全分离，同时各杂质之间分离完全。
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