1. 研究目的与意义
内容：参考中国药典2010版及EP7.0版瑞格列奈片质量标准中的有关物质检查方法，在此基础上优化建立有关物质方法1，进行系统方法学验证，并自主开发优化建立有关物质方法2，比较两种方法测出的杂质是否相当，以验证方法1的准确性，最终确认本品的有关物质检查方法。
意义：糖尿病已经成为全球关注的健康问题之一，近年来，糖尿病患者人数的迅速增加以及糖尿病对人体健康带来的危害促使各医药行业更努力的研究降糖药物。瑞格列奈(Repaglinide) 是非磺脲类促胰岛素分泌剂，通过刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，而不诱导β细胞的凋亡，不良反应较轻，耐受性好，能安全有效的降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖，被称为膳食葡萄糖调节剂。可单用或与其他降糖药合用，如二甲双胍、甘精胰岛素等，具有广阔的市场前景。本论文研究该药的有关物质检查方法，对于准确检查及控制其有关物质具有重要意义，是研究仿制药过程中必不可少的一部分。
2. 文献综述
瑞格列奈片有关物质方法学验证
摘要:（1）对瑞格列奈片质量标准中的有关物质检测方法进行优化,对优化后的系统进行系统的方法学验证,并为考察已知杂质与主成分的响应差异,对已知杂质进行校正因子测定。（2）采用另一套系统对本品有关物质进行检测，比较两套系统检测出的杂质是否相当。
关键词:瑞格列奈;有关物质;高效液相色谱法
瑞格列奈(Repaglinide) 是非磺脲类促胰岛素分泌剂，具有餐时调节体内血糖的治疗特点。其通过模仿生理性胰岛素分泌，可以有规律地控制全日平均血糖避免餐后高血糖和低血糖后反应性高血糖，并减少低血糖事故的发生[1],是一种治疗Ⅱ型糖尿病的新型口服降糖药[2]，尤其适用于治疗与进食有关的葡萄糖水平升高，可使患者尽可能地维持血糖水平接近正常[3]。通过刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，而不诱导β细胞的凋亡[4]，不良反应较轻，耐受性好，能安全有效的降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖，被称为膳食葡萄糖调节剂[5]。可单用或与其他降糖药合用，如二甲双胍[6]、甘精胰岛素[7]等，具有广阔的市场前景。通过对瑞格列奈及其中间体合成的研究发现[8]，瑞格列奈主要存在3种合成中间体，即有关物质A（MPPBA，（1S）-3-methyl-1[2-（piperidin-1-yl）phenyl]butan-1-amine）、B （ECPAA，[3-ethoxy-4-（ethoxycarbonyl）phenyl]acetic acid）、C。有关物质C 是中间体，它直接水解即得到瑞格列奈终产物，且产率较高，纯度经HPLC 法检测可达到99%。本文包括两个有关物质方法学验证,运用高效液相法,一方面定入标准, 对瑞格列奈片质量标准中的有关物质检测方法进行优化,对优化后的系统进行系统的方法学验证,并为考察已知杂质与主成分的响应差异,对已知杂质进行校正因子测定,另一方面为确证性研究,采用另一套系统对本品有关物质进行检测，比较两套系统检测出的杂质是否相当。
一 有关物质方法1方法学验证
参考瑞格列奈片质量标准(中国药典2010年版[10]及EP7.0版[13])中的有关物质检查方法，并进行优化，在此基础上建立了有关物质方法1，并进行系统的方法学验证。验证内容包括：系统适用性、检测限与定量限、已知杂质（USP杂质A、
USP杂质B、USP杂质C）校正因子测定、专属性试验、溶液稳定性、低浓度标准曲线、仪器精密度、耐用性、重复性试验、中间精密度试验、USP杂质A回收率试验等。
1.仪器及试药
岛津高效液相色谱仪(DAD)，型号LC-20AT；AG285电子分析天平；XS205电子分析天平；Kromasil 100-5C18色谱柱（250mm*4.6mm*5μm）；GL Science Inertsil ODS 3V（250mm*4.6mm*5μm）；色谱级Tedia乙腈，磷酸二氢钾，磷酸，盐酸，氢氧化钠及30%过氧化氢均为分析纯；瑞格列奈片（自制，规格：1.0mg/片，批号：20120817，20121017，20121018，20121019）；参比瑞格列奈片（丹麦诺和诺德公司，规格：1.0mg/片，批号：AM70016，AM70659，AM70591）；
瑞格列奈对照品（中国食品药品检定研究院 批号：100753-201102）；USP杂质A（USP Rockville，MD 批号：G0J300）；USP杂质B（USP Rockville，MD 批号：F0B269）；USP杂质C（USP Rockville，MD 批号：G0E181）
2.色谱条件
色谱柱：Kromasil 100-5C18色谱柱（250mm*4.6mm*5μm）
柱温：45℃
流动相A：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾4.0g，加水约900ml溶解后，用磷酸调节pH值至2.40.1，再加水至1000ml）
流动相B：流动相A（35:65）
按下表进行线性梯度洗脱：
时间（min） | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 55 | 45 |
15 | 25 | 75 |
25 | 20 | 80 |
30 | 0 | 100 |
45 | 0 | 100 |
流速：1.0ml/min
进样量：20μl
检测波长：240nm
3.溶液的配制
① 空白溶剂：流动相B
② 瑞格列奈原料药溶液：称取瑞格列奈原料药适量（约25mg），精密称定，置25ml量瓶中，加流动相B适量，振摇使瑞格列奈溶解，并用流动相B稀释至刻度，摇匀，作为瑞格列奈原料药溶液；
③ 瑞格列奈对照品溶液：称取瑞格列奈对照品适量（约10mg），精密称定，置10ml量瓶中，加流动相B适量，振摇使瑞格列奈溶解，并用流动相B稀释至刻度， 摇匀，作为瑞格列奈对照品溶液；
④ 供试品溶液：称取本品细粉（20120817，AM70659）适量（约含瑞格列奈25mg），精密称定，置25ml量瓶中，加流动相B适量，振摇使瑞格列奈溶解，并用流动相B稀释至刻度，摇匀，过滤，续滤液作为供试品溶液；
⑤ 空白辅料溶液：按处方量，称取空白辅料适量，同法配制成空白辅料溶液；
⑥ USP杂质A/B/C对照品溶液：称取USP杂质A/B/C对照品适量（约10mg），置50ml量瓶中，加流动相B适量，振摇使瑞格列奈溶解，并用流动相B稀释至刻度，摇匀，作为USP杂质A/B/C对照品溶液；
4.系统适用性试验
考察空白溶剂与空白辅料是否干扰本品杂志测定；考察主峰与各杂峰的分离度、理论塔板数等；考察各杂志对照保留时间与峰面积的相对标准偏差。
5.检测限与定量限
按信噪比S/N=10作为定量限，按信噪比S/N=3作为检测限，同时考察定量限与检测限的精密度。（瑞格列奈、USP杂质A、USP杂质B、USP杂质C）
6.杂质校正因子研究
将三个杂质USP杂质A、USP杂质B、USP杂质C作为瑞格列奈片的已知杂质进行研究，测定其相对瑞格列奈的校正因子。分别绘制USP杂质A、USP杂质B、USP杂质C的标准曲线，同时测定瑞格列奈相应浓度的标准曲线。瑞格列奈标准曲线与杂质标准曲线的斜率之比即为该杂质相对瑞格列奈的校正因子。由不同人员在不同时间采用不同仪器测定。
7.专属性试验
从以下几方面进行考察：
① 将已知杂质加入原料药中，配制混合溶液，考察已知杂质与主峰的分离情况
② 强制降解试验（高温、强酸、强碱、氧化、光照破坏）考察主成分与其降解产物的分离情况，并对主成分峰纯度进行分析
③ 将强制降解试验中自制样品与原研样品的降解产物进行比较判断已知杂质（USP杂质A、USP杂质B、USP杂质C）是否为降解产物
8.溶液稳定性
以各单杂及总杂在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h的变化量来考察供试品溶液放置的稳定性。
9.仪器精密度
取瑞格列奈对照品溶液，精密量取2.0ml置20ml量瓶中，加流动相B稀释至刻度作为仪器精密度考察供试品溶液（相当于自身对照溶液浓度），连续进样6次，考察仪器精密度。
10.耐用性试验
按照中国药典2010版二部附录[15]的要求对本方法的耐用性进行考察，将通过改变流动相pH值、比例、流速、柱温、色谱柱来评估测定条件有微小变化时，测定结果不受影响的承受程度。
11.重复性试验
以主成分自身对照法计算供试品溶液总杂含量以及最大单个杂质含量，平行测定6份，考察重复性。
12.中间精密度试验
由不同人员在不同时间采用不同仪器对本品的有关物质进行测定，以主成分自身对照法计算供试品溶液总杂含量以及最大单个杂质含量，看是否相当。
13.回收率试验
对相对瑞格列奈校正因子较大的杂质进行回收率试验，考察有关物质测定方法检测该杂质的准确度。（用外表法计算）
14.有关物质方法1有关物质测定
供试品溶液色谱图中若有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（1.5%）【放行标准：单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍（0.1%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.8倍（0.8%）】
二 有关物质方法2方法学验证
为了验证有关物质方法1的准确性，采用另外一套系统对本品的有关物质进行测定，建立有关物质方法2，比较两套系统检测出的杂质是否相当。有关物质方法2为自主开发方法，并进行相关方法学验证，包括系统适用性、检测限、专属性试验、溶液稳定性、低浓度标准曲线、仪器精密度、重复性试验、中间精密度等。
1. 仪器与试药
与方法1一致
2.色谱条件
色谱柱：Kromasil 100-5C18色谱柱（250mm*4.6mm*5μm）
柱温：35℃
流动相A：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾2.0g，加水约900ml溶解后，用磷酸调节pH值至3.00.1，再加水至1000ml）
流动相B：乙腈
流速：1.0ml/min
进样量：20μl
检测波长：240nm
按下表程序进行梯度洗脱：
时间（min） | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 60 | 40 |
10 | 60 | 40 |
15 | 50 | 50 |
35 | 50 | 50 |
40 | 40 | 60 |
60 | 40 | 60 |
3. 系统适用性、检测限、专属性试验、溶液稳定性、低浓度标准曲线、仪器精密度、重复性试验、中间精密度
验证方法同方法1
三 讨论
1.检测波长的选择
精密量取空白溶液、空白辅料溶液、原料药溶液、对照品溶液与供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪（二极管阵列检测器），记录色谱图。结果表明，空白溶剂及空白辅料对本品有关物质的测定无干扰；瑞格列奈主峰在239nm与240nm波长处有最大吸收；已知杂质USP杂质A在250nm波长处有较大吸收，杂质USP杂质B在240nm波长处有较大吸收，杂质USP杂质C在242nm波长处有较大吸收；尝试对本品进行适当的破坏后，观察降解杂质的最大吸收波长，结果显示降解杂质多在240nm波长处有最大吸收；对自制样品进行光照破坏，出现保留时间为40.340min和42.317min的杂质，这两个杂质分别在244nm与245nm波长处有最大吸收，对比其在240nm波长下与245nm波长下的吸收值，结果发现这两个杂质在240nm与245nm两个波长下的吸收相差不大，因此波长选择为240nm亦可以有效检测出这连个杂质。
有关物质检测波长应尽可能兼顾所以杂质或大多数杂质的最大吸收波长，因此本品有关物质测定波长选择为240nm，与多国药典标准中有关物质检测波长一致。
2.流动相的选择
瑞格列奈在多国药典中均有收载，且部分药典标准中对本品有关物质进行了良好的控制，将各标准有关物质检测方法进行比较（片剂质量标准CP2010版[10]、原料药EP7.0版[13]、进口注册标准[14]、原料药质量标准USP34版[11]、片剂质量标准USP34版[12]）可知，中国药典方法与EP7.0方法较为接近，均为梯度洗脱，水相为磷酸二氢钾缓冲液，缓冲盐浓度相同，磷酸调pH值至3.2，B相为水相与乙腈的混合溶液；比较两者梯度程序，中国药典方法梯度程序时间长，梯度缓慢变化，EP7.0方法B相20min时即达到93%，且EP7.0方法流速为1.5ml/min，洗脱迅速，综合考虑，采用中国药典方法进行试验，推断该方法更有利于杂质的分离。
进口药品注册标准方法与USP34版原料药方法叫接近，梯度洗脱，水相为磷酸二氢钾缓冲液，1mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0；梯度程序初始流动性甲醇比例为50%，后甲醇比例达到95%，整个程序中有机相比例较高，不利于辅料峰、杂质峰的分离，因此不采用此系统进行试验。
USP34版片剂的有关物质检测方法采用等度洗脱，水相为磷酸二氢铵缓冲液，磷酸调pH至2.5；水相与甲醇比例为3:7，等度洗脱且有机相比例较高，不利于辅料峰、杂质峰的分离；供试品浓度为0.08mg/ml，进样量仅为1.6ng，进样量较低，不能有效检出各杂质，因此不采用此系统进行试验。
参考文献：
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[2] 林聪,马红玲,刘丹琦,吕淑河,李雪如,徐平声.高效液相色谱法测定瑞格列奈片中的有关物质[J]. 中南药学 2013,11(6):467
[3] 孙浩，蒋素梅，顾萍，李语如.HPLC法测定瑞格列奈原料药及其片剂中主药和有关物质的含量[J]. 中国药房 2007,18(19):1496
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[5] 许青.新型降血糖药瑞格列奈[J] .中国新药与临床杂志，2001,19(6）：502.
[6] 金绍礼.瑞格列奈联合二甲双胍治疗初发Ⅱ型肥胖型糖尿病的疗效观察[J]. 中国药房，2011,22(20):1876-1877.
[7] 任向东.甘精胰岛素与瑞格列奈联用治疗Ⅱ型糖尿病的临床研究[J]. PJCCPVD实用心脑肺血管杂志，2012,20(1):18-19.
[8] 彭勇，郑学忠，赵亚楠. 瑞格列奈及其中间体合成的研究进展 [J].河南师范大学学报，2010,34(1):89-92.
[9] 中国药典2010年版 瑞格列奈原料药质量标准
[10]中国药典2010年版 瑞格列奈片质量标准
[11]USP34版 瑞格列奈原料药质量标准
[12]USP34版 瑞格列奈片质量标准
[13]EP7.0版 瑞格列奈原料药质量标准
[14]JX20080253 瑞格列奈原料药进口药品注册标准
[15]中国药典2010年版 二部附录
3. 设计方案和技术路线
研究方案：①参考各国药典该药物的有关物质测定方法，选择较优方法并
进行优化后建立方法1。
②对优化后的系统进行系统的方法学验证并测定有关物质
4. 工作计划
第一阶段：2022.1.5-2022.2.1 参考药典，查阅资料，形成初步思路，制定
初步方法
第二阶段：2022.2.1-2022.4.10 准备仪器，试剂，试药及对照品，摸索
5. 难点与创新点
试验采用中国药典2010版中瑞格列奈片质量标准中有关物质检查方法，并对之进行优化，因为在中国药典的色谱条件下，主峰前延，峰形不好，通过调节水相的pH值，改变流动相的比例等来改变峰形，优化色谱条件，最终确定最优条件，从而有效分离主峰与各杂质峰。
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