1. 研究目的与意义
本次除菌过滤的工艺验证是在南京海辰药业股份有限公司6车间（冻干车间）进行的，6车间配液系统目前所用的滤芯为上海格氏过滤设备有限公司所提供的聚醚砜10英寸、0.45μm、0.22μm滤芯。
为了证明注射用更昔洛韦钠（0.25g）通过此配液系统除菌过滤，除菌过滤的有效性和可靠性，故进行本次注射用更昔洛韦钠除菌过滤的工艺验证。
其除菌过滤设计流程为：药液经一道0.45μm滤芯过滤后再经2道0.22μm滤芯除菌过滤至药液接收间的药液接收灌中，灌装过程中接收罐内的药液经循环泵及管道输送至30L缓冲罐中并经第三道0.22μm滤芯过滤后用于灌装半加塞。本次验证通过在药液除菌过滤时对各级过滤器前后药液取样，检测药液的微生物截留量、有关物质、含量、颜色与澄清度等项目，并在药液经2道0.22μm滤芯过滤后对滤芯进行完整性测试，证明该过滤器系统除菌过滤的有效性和可靠性，符合该产品的生产除菌过滤工艺要求。
2. 文献综述
文献综述
注射用更昔洛韦钠除菌过滤的工艺验证
1.摘要：注射用更昔洛韦钠适用于免疫功能缺陷者（包括艾滋病患者）发生的巨细胞病毒性视网膜炎；预防可能发生于接受器官移植者的巨细胞病毒感染。本文就注射用更昔洛韦钠的基本概况、该品种除菌过滤工艺验证的方法作一综述。
关键词 注射用更昔洛韦钠；除菌过滤；工艺验证；有关物质；含量；可见异物
一、更昔洛韦钠基本概况
1.1药品名称
通用名称：注射用更昔洛韦钠
商品名称：林可宏
英文名称：GanciclovirSodiumforInjection
汉语拼音：ZhusheyongGengxiluoweina
1.2成份
本品主要成份为更昔洛韦钠。
化学名称：9-（1，3-二羟基-2-丙氧甲基）-鸟嘌呤单钠盐
化学结构式：
分子式：C9H12N5NaO4
分子量：277.22
1.3性状
本品为白色或类白色的疏松块状物或粉末。
1.4规格
本品按C9H12N5NaO4计算，分为0.25g和0.5g两种。
1.5适应症
2.免疫功能缺陷者（包括艾滋病患者）发生的巨细胞病毒性视网膜炎。
3.预防可能发生于接受器官移植者的巨细胞病毒感染。
1.6用法用量
1.治疗巨细胞病毒感染性视网膜炎。肾功能正常者诱导期：静脉滴注，每次5mg/kg，一日2次，连用14~21天。维持期：静脉滴注，每次5mg/kg，一日1次，连用7天，或一次6mg/kg，一日1次，连用5天维持治疗。每次静脉滴注时间不少于1小时。肾功能异常者参照下表，或遵医嘱。
2.预防可能发生于接受器官移植者的巨细胞病毒感染。肾功能正常者：静脉滴注，一次5mg/kg，每12小时一次，连用7天~14天后，改为一次5mg/kg，一日1次，一周用7天，或一次6mg/kg，一日1次，每周用5天，或遵医嘱。每次静脉滴注时间不少于1小时。肾功能损伤者根据肌酐清除率酌情调整用量，具体见下表：
表1肾功能损害者用药参考
诱导期 | 维持期 | |||
肌酐清除率（mL/min） | 剂量 （mg/kg） | 间隔时间 （h） | 剂量 （mg/kg） | 间隔时间 （h） |
≥70 | 5.0 | 12 | 5.0 | 24 |
50~69 | 2.5 | 12 | 2.5 | 24 |
25~49 | 2.5 | 24 | 1.25 | 24 |
10~24 | 1.25 | 24 | 0.625 | 24 |
1.25 | 血液透析后使用，3次/周 | 0.625 | 血液透析后使用，3次/周 |
本品静脉滴注时，配置方法如下：首先根据患者体重确定使用剂量，用适量注射用水或生理盐水使之溶解，浓度达50mg/ml，再注入0.9%氯化钠溶液、5%葡萄糖溶液、林格氏液或乳酸林格氏液100ml中静脉缓慢滴注，滴注液浓度不得大于10mg/ml。
1.7不良反应
较易发生粒细胞减少症、贫血症或血小板减少症。尚可见：视网膜脱落、头痛、头昏、呼吸困难、恶心、呕吐、腹疼、腹泻、厌食、消化道出血、心律失常、血压升高或血压下降、寒战、血尿、血尿素氮增加、脱发、瘙痒、荨麻疹、血糖降低、浮肿、周身不适、肌酐增加、嗜睡等。
1.8注意事项
1.一次最大剂量为6mg/ml，充分溶解后，缓慢静滴。溶液呈强碱性，故滴注时间不得少于1小时，避免与皮肤、黏膜接触，避免液体渗漏到血管外组织。
2.白细胞计数低于500/mm3或血小板计数低于25000/mm3患者慎用。
3.肾功能损害者慎用。
1.9药物相互作用
影响造血系统的药物、骨髓抑制剂及放射治疗等与本品同用时，可增加对骨髓的抑制作用。
1.10药理毒理
药理作用
本品为一种2-脱氧鸟嘌呤核苷酸的类似物，可抑制疱疹病毒的复制，其作用机理是：更昔洛韦首先被巨细胞病毒CMV（UL97基因）的蛋白激酶同系物磷酸化成单磷酸盐，再通过细胞激酶进一步磷酸化成二磷酸盐和三磷酸盐。在CMV感染的细胞内，三磷酸盐的水平比非感染细胞中的水平高100倍，提示本品在感染的细胞中可优先磷酸化。更昔洛韦一旦形成三磷酸盐，能在CMV感染的细胞内持续数天。更昔洛韦的三磷酸盐被认为能通过以下方式抑制病毒的DNA合成：1）竞争性的抑制病毒DNA聚合酶；2）共同进入病毒DNA内，从而导致病毒DNA延长的终止。
临床已证实，本品对巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒（HSV）所致感染有效。
毒理作用
遗传毒性：更昔洛韦浓度分别为50-500μg/ml及250-2000μg/ml时，体外可增加小鼠淋巴瘤细胞的突变和人淋巴细胞DNA的损伤。在小鼠微核试验中，更昔洛韦在150mg和500mg/kg（iv）（以AUC计算，相当于人暴露量的2.8至10倍）时，有致裂变作用，但在50mg/kg（以AUC计算，与人用药剂量相当）时无此作用。Ames沙门氏菌试验表明，更昔洛韦在500-5000μg/ml浓度下无致突变作用。
生殖毒性：雌性小鼠静脉给予更昔洛韦90mg/kg/日（以AUC计算，约相当于人给药剂量为5mg/kg平均暴露水平的1.7倍），可引起交配行为减少，生育能力降低，并增加胚胎死亡率。每日口服或静脉给予本品剂量范围在0.2-10mg/kg时，可引起雄性小鼠生育力下降，并降低小鼠和狗的生精能力。不同种族动物显示毒性反应的最低剂量下AUC范围为推荐人静脉剂量下AUC的0.03-0.1倍。
更昔洛韦静脉给药，对家兔和小鼠显示有胚胎毒性，并对家兔有致畸作用。在给药剂量分别为60mg/kg/日及108mg/kg/日（相当于人的2倍AUC）下，至少85%的家兔和小鼠出现胚胎重吸收。在家兔观察到的作用包括：胚胎生长迟缓、胚胎死亡、致畸和/或母体毒性。致畸作用包括：上颚裂、无眼畸形或小眼畸形、器官发育不全（肾和胰腺）、脑积水和短颌。在小鼠可观察到母体/胚胎毒性和胚胎死亡。
雌性小鼠在交配前、孕期和授乳期，每日静脉给予90mg/kg，可引起达1月龄的雄性动物后代睾丸及精囊发育不全，以及胃的非腺体区病理改变。以AUC计算，小鼠的暴露剂量约相当于人AUC的1.7倍。
更昔洛韦在人用的推荐剂量水平，可能引起致畸和胚胎毒性。没有对妊娠妇女进行充分的、严格对照的研究，故只有在充分显示治疗益处超过对胎儿的潜在危害时方可在妊娠期使用本品。
对更昔洛韦是否分泌入人类乳汁的情况尚不清楚。但是，由于许多药物可分泌入人乳，且更昔洛韦治疗可引起动物致癌和致畸，所以应当考虑哺乳妇女在接受治疗时停止授乳。
致癌性：小鼠经口给予更昔洛韦剂量为20和1000mg/kg/日时，有致癌作用（以AUC计算，分别约相当于人静脉给予推荐剂量5mg/kg/日的0.1和1.4倍）。当剂量为1000mg/kg/日时，显著增加雄性小鼠包皮腺、雌性和雄性小鼠前胃（非腺性黏膜）、雌性小鼠生殖组织（卵巢、子宫、乳腺、阴蒂腺和阴道）及肝脏的肿瘤发生率。当剂量为20mg/kg/日时，轻度增加雄性小鼠包皮腺和副泪腺、雌性和雄性小鼠的前胃和雌性小鼠肝脏的肿瘤发生率。当小鼠服用更昔洛韦的剂量为1mg/kg/日（以AUC计算，相当于人用剂量的0.01倍）时，未观察到致癌作用。除肝脏的组织细胞肉瘤，更昔洛韦引起的肿瘤一般为上皮或血管源性。虽然小鼠的包皮腺、阴蒂腺、前胃及副泪腺在人类没有相应的组织部位，但应考虑更昔洛韦对人体有潜在的致癌作用。
二、冻干工艺
冻干又称真空冷冻干燥。它是物质干燥的一种方法。冻干技术目前在国外比较流行，广泛应用于医药和生物制剂方面，其营养损失最小，且复原性最好。
2.1生产工艺过程
2.1.1原料、辅料经称量后用注射用水溶解配制配液。
2.1.2配制液经粗滤去除杂质，而后经除菌过滤工艺后送至滤液接受装置待灌装，滤液贮存的周边环境为B级。
2.1.3内包材（玻璃瓶）在灌装机内局部A级环境保护下灌装药液和半上胶塞。
2.1.4灌装后的半成品在层流洁净空气的保护下或用带RABS系统的轨道小车（AGV）自动输送到冻干机干燥箱内，冻干和干燥完毕后全压塞。
2.1.5已干燥完毕并封塞的半成品用AGV输送小车运送到轧盖工序轧盖密封（轧盖工序设置在轧盖的B级区域，在分瓶装置的RABS下与AGV接口对接），通过传送带传输到轧盖机轧盖密封。干燥后的半成品也可由人工出箱，用带单向流保护的小车分别运输到在周边环境为B级的条件下，局部A级环境下进行轧盖。
2.1.6轧盖后的半成品通过气锁室和气帘后，进行检漏、灯检、包装。[4]
三、工艺验证
新版的中国GMP检查指南中验证的定义是:证明任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统能达到预期结果的有文件证明的一系列活动。预期结果即是原则上的合格标准。没有经过验证的工艺,是不可能始终如一的保证药品质量的。因此,我们说药品生产工艺验证是一个全面的概念,包括影响药品质量的各种因素。工艺验证是达到质量保证目标的关键要素。通过详细的设计和对工艺和工艺控制的验证,可以帮助一个药品生产企业建立高度的自信,即保证所有的连续批量生产的产品是符合质量标准的。对一个工艺的成功验证可以减少对在线测试和成品测试的依赖性[1]。
验证是保证药品生产过程质量体系有效运行的手段之一。工艺验证强调生产工艺的重现性和稳定性，是一项复杂的系统工程，需要采取周密的计划、严格的实验寻找出那些恰当的要素，包括最优的生产条件、操作参数、工艺限度以及原材料的投入;何时、怎样对其进行评估;每一个重要工艺步骤应做的检测(中间控制、放行和特性)以及验收标准，要用收集到的数据来证明过程的可靠性，从而确信产品能满足规定的质量要求。同时，工艺验证也体现了工艺参数对边缘条件、苛刻条件的重复性和一致性，对工艺条件下限、中限、上限进行验证，确定是否能得到质量特性控制的值，从而保证在高风险条件下能够一贯地生产出优质产品。由于产品质量形成于设计和生产过程中，因而不能仅仅只对生产过程进行验证。美国食品和药物管理局(FDA)新的指南草案将整个验证过程分成了工艺设计、工艺确认、持续工艺核实3个阶段，从设计开发阶段开始就控制产品质量，这充分体现了质量保证的意义。[2]
药品生产工艺验证的基础是工艺设备及辅助系统已经完成验证,并且符合要求。因此,在进行工艺验证前,要求该工艺的每一个重要的要素都需要经过属性认定。某个要素的相对重要性可以随工艺的不同而有所变动。通常在工艺验证研究中所要考虑的要素包括:分析检验规程、仪器仪表校准、重要的支持系统、操作人员的培训、原材料和包装材料、设备、厂房设施和产品设计等。
四、含量和有关物质检查
4.1概述
除菌过滤工艺最重要的目的是除菌，验证中对微生物含量和过滤后无菌性的监察必不可少，同时过滤也有可能带来一些附加作用或副作用。若过滤器选择不当，除菌过滤系统不符合该产品药液的除菌过滤工艺要求，可能对药液出现溶出物和析出物、对药液有吸附、与溶液化学不兼容等负反应，使药液含量降低，有关物质和可见异物增加。同时除菌过滤也可能滤掉药液杂质，使有关物质减少。对除菌过滤的工艺验证需要对这些数据进行收集比较，找到一个平衡点，保证副作用在可接受的范围内的同时正反应得到最大优化。
4.2验证方法
4.2.1有关物质
4.2.1.1HPLC条件与系统适用性
以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，以甲醇-0.05mol/L磷酸盐缓冲液（用磷酸调节PH至3.0）（5:95）为流动相，检测波长为254nm，柱温箱30℃，流速1.0ml/min，进样20μl。理论塔板数以更昔洛韦钠峰计算应不少于2000.更昔洛韦钠峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。
4.2.2.2测定法
吸取供试品3ml，置于100ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；吸取5ml上述溶液，置于50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1ml，置于100ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（1）.另取鸟嘌呤对照品适量，加0.4%氢氧化钠溶液适量使溶解，加流动相制成每1ml中含1.25μg的溶液作为对照溶液（2）；分别取对照溶液（1）和对照溶液（2）各1ml，混合均匀，作为对照溶液（3）。量取对照溶液（3）20μl，注入液相色谱仪，更昔洛韦钠与鸟嘌呤的色谱峰分离度应大于1.5。量取对照溶液（1）20μl，注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰峰高为满量程的25%，再精密量取供试品溶液和对照溶液（1）、（2）各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍。药液中的总杂质以及鸟嘌呤杂质峰按如下公式计算：
总杂质（%）=A总杂/A对11.0%
鸟嘌呤杂质峰（%）=A杂质/A对20.5%
式中：A对-对照溶液主峰面积之和；
A总杂-供试品溶液杂质峰面积之和；
A单-单个最大杂质峰面积。
4.2.2含量测定
精密吸取供试品3ml（约相当于更昔洛韦250mg），置于50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密吸取2ml置于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密吸取5ml置于50ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。取上述两种溶液测定，在252nm处测定其吸收度，按C9H13N5O4的吸收系数（E1m）为532计算更昔洛韦含量。
计算公式：
4.2.3颜色与澄清度
4.2.3.1澄清度
取本品0.5g，分别加水10ml溶解后观察溶液是否澄清。
参考文献：
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[11]郑军，郑金旺.除菌过滤器完整性检测及风险评估[J].医药工程设计，2011，32（4）：30-33
3. 设计方案和技术路线
一、研究方案
收集该三批产品药液除菌过滤时间，作为相同批量规格该产品药液除菌过滤时间的判断依据。测试过滤后溶液无菌性及过滤器完整性，测试结果作为判断过滤器除菌效果是否合格的依据。
4. 工作计划
第一阶段：2022.01-02文献综述，思路形成，实验方案制定；
第二阶段：2022.02学习液相知识、参观车间了解生产知识；
第三阶段：2022.03初步试验、实验条件选择；
5. 难点与创新点
目前关于注射用更昔洛韦钠的工艺验证相关研究还比较少，本研究对于注射用更昔洛韦钠的生产优化还是有较为重大的意义的。
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