郁金散提取物及其组方药物成分对大肠杆菌耐药性的影响开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

随着我国经济快速发展，人们对各肉类食品的需求不断增大，养殖场为了满足市场需求，大量使用抗生素，导致很多细菌产生严重的耐药性，并导致很多疾病无法治疗。大肠杆菌病是养殖业中最常见的一类细菌性疾病，大肠杆菌的耐药性日益严重，给养殖业带来了巨大的损失。本课题拟研究郁金散提取物及其组方药物成分对大肠杆菌耐药性的影响，为临床合理给药提供科学依据。

1.1大肠杆菌的危害

大肠杆菌为革兰氏染色阴性无芽孢的直杆菌，作为正常菌群而存在于人和动物的肠道中，大多数于正常条件下是不致病的共栖菌。但当机体抵抗力下降或侵入肠外组织，可作为条件致病菌引起肠道感染而导致大肠杆菌病。通过粪便传播，多经消化道感染，也可通过呼吸道感染，严重危害食品安全和人类健康^[1]。在兽医临床上，致病性大肠杆菌引起的畜禽大肠杆菌病已经成危害养殖业最普遍发生的、最主要且防治最棘手的疾病之一。

猪致病性大肠杆菌(Escherichia coli)是猪大肠杆菌病的病原菌。猪大肠杆菌病是主要危害仔猪生长发育的一种常见病和多发病。本病在仔猪的临诊表现各有不同，主要有黄痢型、白痢型和水肿型。近年来，本病的发病范围不断增广、发病率不断升高、病死率逐渐上升，已逐渐由条件性致病变成一种新的背景性常发病和多发病。猪群中大肠杆菌病的发病率已达到 60%以上，其中仔猪黄痢的发病率高达25%以上，仔猪白痢的发病率也将近90%，仔猪水肿病的发病率达15%。仔猪黄痢的死亡率超过56%；仔猪白痢的死亡率超过20%；水肿病的死亡率超过90%^[2,3]。虽然疫苗防疫也能在一定程度上控制本病，但由于各场的致病性大肠杆菌的菌型不一，很难使用同一种菌苗而获得普遍的效果。造成目前这种严峻的局面主要原因之一是致病性大肠杆菌的耐药性日益严重。由于临床上抗菌药物的滥用导致E . coli 耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，呈多重耐药趋势，严重危害了养殖业的健康发展^[4]。

1.2 大肠杆菌耐药性日益严重

大肠杆菌血清型复杂，无法用疫苗治疗，所以，临床的治疗方法多为抗生素治疗。由于抗菌药物的不合理使用，细菌耐药性问题日趋严重和复杂，给临床抗感染治疗带来极大的挑战，这已成为全球关注的焦点^[5]。

自从第一个抗生素青霉素发现以来，人类研制、开发了多种抗菌药物，使细菌引感染性疾病得到了有效的控制与治疗。然而随着抗生素的不断应用，尤其是在人类的疾病治疗中及农牧业生产中大量不当使用，使细菌对抗生素的耐药问题越来越突越来越严重，已经直接威胁到公众的健康。细菌的耐药性对于动物健康的威胁也绝不亚于禽流感、新城疫、蓝耳病等任何一种重大疫病^[3]。杜向党等^[6]报道，91株鸡源性大肠杆菌对恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星的耐药率均为100%，且存在交叉耐药。邢艳萍等^[7]对吉林省长春市伊通地区分离出的113株动物源性大肠杆菌进行22种常用抗生素的药敏试验，结果显示，113株对喹诺酮类、磺胺类、利福平耐药率达到90%以上，均表现不同程度的耐药，耐药谱广，且以多重耐药为主。汤景元等^[8]研究了2007年19个省95个规模化猪场分离的480株大肠杆菌对19种抗生素的耐药性，结果表明，13重以上耐药菌株占一半以上，有26株18重耐药，14株19重耐药，多重耐药性非常严重。近年来，细菌对抗生素的耐药率逐年上升，居高不下，而且耐药菌产生之快、传播之迅速、耐药谱之广和耐药水平之高是前所未有的^[9]。

1.3 大肠杆菌耐药性的研究现状

1940年一种能够水解青霉素的酶被Chain和Abyaahm从大肠杆菌体内分离和鉴定出来，至此人们了解到即使在没有使用任何抗生素之前，大肠杆菌就存在着固有耐药性。这一发现说明细菌的耐药性是大肠杆菌在不利于生存的环境中为了增强自身生存能力而产生的一种重要的自身防卫系统，而并不仅仅是反复用药的结果。这也是大肠杆菌容易产生耐药性的自身原因。

就目前的研究现状看，大肠杆菌的耐药机制主要有以下5种：①抗生素作用位点的改变或新作用位点的产生，青霉素类、氟苯尼考类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类耐药性的产生为此机制；大肠杆菌对青霉素类的耐药性产生为细菌细胞内膜上的靶位点（即PBP）改变，对氟苯尼考类的耐药性产生为大肠杆菌获得了位于质粒上的抗性基因floR并表达了其抗性，对氨基糖苷类的耐药性产生多为耐药菌染色体上的基因发生突变，对氟喹诺酮类耐药的最主要原因为氟喹诺酮类药物作用位点编码旋转酶的gyrA、gyrB基因、编码拓扑异构酶IV的parC、parE基因的点突变。②酶对抗生素的修饰和破坏，包括氨基糖苷类钝化酶、β-内酰胺酶、乙酰转移酶（耐氯霉素）和酯酶（耐大环内酯类）；③增加抗生素从大肠杆菌向细胞外的主动排出作用；④细菌外模通透性的改变；⑤质粒介导的耐药性。一种耐药机制可以对多种抗生素表现为抗性，同一种抗生素也常常出现多种耐药性机制共同抑制的现象^[10]。

鉴于细菌耐药的严重性和复杂性，减缓细菌耐药性的产生，部分或全部恢复其对抗生素的敏感性成为当今人们关注的焦点。中草药的低毒性、普遍性，使探索它们对耐药性的影响成为一种新途径。

1.4 中药对耐药性的影响

中药是我国的国粹，具有较广泛的抗菌谱，且细菌对多数中药尚无耐药性。中药的临床使用剂量，从《本草纲目》记载以来直到现在，一般人类的用量仍然维持在10~15克左右，细菌对之没有表现出明显的耐药现象。

从中草药中发现和提取某些天然活性物质制备耐药菌抑制剂逐步替代传统的抗生素及化学药物饲料添加剂，可以极大的减少了病原菌对抗菌药物的耐药性及在动物体内残留，减少对人类和动物的危害^[3]。鞠洪涛^[11]等发现艾叶的乙醇提取物对大肠杆菌耐庆大霉素 ( GM )耐药性及耐药质粒消除率最高可达 69. 4% , 艾叶挥发油的消除率达16. 67%。刘晓颖^[12]对双黄连和氧氟沙星对肠道杆菌携带的耐药质粒pRst98进行了消除研究，发现两种药物使pRst98质粒编码的耐药标志减少，部分菌株对原有药物的耐药程度明显下降。王永芬^[3]等发现石榴皮、黄芩、黄连对猪致病性 E. coli 具有质粒消除和耐药性逆转作用，其中黄连作用效果最好。而将黄连与黄芩配伍后，对大肠杆菌R质粒消除率从2.42%提高到22.37%^[13]。由此可见，中药对大肠杆菌的耐药性有一定的抑制和逆转作用。本课题拟选用传统中药复方郁金散提取物及其主方药物成分，研究其对大肠杆菌耐药性的影响，旨在为临床合理给药提供科学依据。

郁金散出自明代《元亨疗马集》，具有清热解毒，涩肠止泻的功效，主治肠黄和湿热泄痢等实热证。方中郁金清热凉血，行气散瘀，黄连、黄芩、黄柏清心、大肠、肺等脏腑之热毒，栀子清上、中、下三焦之火，白芍、诃子敛阴而止泻，大黄清血热，下积滞。急性胃肠炎、痢疾等属于热毒壅极者，均可酌情加减应用^[14]。事实上，辨证论治、理法方药等理论是中兽医临床用药的重要指导原则，因此郁金散临床应用灵活多变，需兼顾具体疾病的病理联系，并随症加减，可极大扩展其应用范围^[15]。

1.5 本课题的研究目的和意义

大肠杆菌是临床感染中最常见的病原菌之一，它可以通过食物感染人类，导致人类食物中毒的主要病菌之一，日趋严重的耐药性也可以同时传递给人类。大肠杆菌耐药尤其是多重耐药严重影响了临床的治疗效果。因此，大肠杆菌耐药性问题已成为十分重要的全球性公共卫生问题。目前已用于临床的天然抗生素、合成或半合成生产的新抗生素将近有200多种，它们的应用已经成为医药市场的支柱，并成为医药卫生世界的脊梁。正是由于抗菌药物的持续、广泛和不恰当使用，使各科病菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。并且随着耐药谱的不断扩大和耐药水平的不断提高，多数的大肠杆菌对抗生素都极易产生多重耐药性。

我国中医药历史悠久，中药资源丰富，我国人民用中药治疗疾病有非常丰富的经验，很多中药本身具有抗菌活性，且具有天然、高效、低毒副作用、无残留、无公害、不易产生耐药性的特点^[16]。因此，研究中药对大肠杆菌耐药性的影响，对于临床正确合理使用抗菌药物，减少药物残留从而保证动物性食品的安全，以及控制细菌耐药性的蔓延都具有重要意义。

参考文献：

[1] 陈溥言.兽医传染病[M].第五版.北京：中国农业出版社，2006：111-113.

[2] 陈甜甜，杨忠福，刘建柱. 猪大肠杆菌病研究进展[J].猪业科学，2008,8:20-25.

[3] 王永芬，席磊，边传周，乔宏兴，赵志军. 猪致病性大肠杆菌耐药质粒检测及其中药消除作用研究[J]. 中国预防兽医学报，2011,33（12）：932-935.

[4] Hamer D H, Gerald J , Friedman D R , et al . From the farm to the kitchen table: The negative impact of antimicrobial use in animals on humans[J].Nutr Rev, 2002 , 60(8) : 261-264 .

[5] 刘玉芹， 张秀英，马得莹, 李群道. 中草药抗仔猪大肠杆菌性腹泻作用机理的研究[J].畜牧兽医学报, 2005 , 36( 6) , 620-624.

[6] 杜向党，李新生，秦尚上，等.鸡源大肠杆菌介导的氟喹诺酮类药物基因qnrA的分子检测[J].中国畜牧兽医，2008,35(5):28-30.

[7] 邢艳苹，王瑜，杨峰，等.动物源性大肠杆菌耐药性分析［J］．吉林畜牧兽医，2010，31( 11) : 7-10．

[8] 汤景元，王红宁，张鹏举，等.95个猪场大肠杆菌耐药表型及氨基糖苷类药物耐药基因型调查[J].畜牧兽医学报，2008,39（4）：472-477.

[9] 王晓波.中药复方连黄对金黄色葡萄球菌耐药基因femA影响的研究(D).延吉：延边大学，2008.

[10] 教郁，高维凡，胡彩光.大肠杆菌耐药性研究进展[J].现代畜牧兽医.2013,(05).55-57.

[11] 鞠洪涛, 韩文瑜, 王世若, 等.大肠杆菌耐药基因定位及耐药质粒消除[J].中国兽医学报, 2000, 20 ( 6) : 561-565.

[12] 刘晓颖，黄瑞，陆明，等.药物在体外消除肠道杆菌携带的耐药质粒pRst98的研究[J].苏州大学学报，2002，22（3）：252-257.

[13] 陈群, 王胜春. 黄芩和黄连对大肠埃希氏菌 R质粒消除作用的实验研究[J]. 广东医学院学报, 1998, 16 ( 1 ) :1-3.

[14]胡元亮.中兽医学[M].第一版.北京：科学出版社，2013:90.

[15]牛峰，刘玉宏，王龚.加味郁金散治疗大家畜急性肠炎[J].河南畜牧兽医.2003,19(11):40.

[16]姚永瑞.中药消除剂对大肠杆菌耐药性消除作用的研究[D].重庆：西南大学，2008.

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

2.1 研究目标

本课题选用大肠杆菌标准菌株，用常见的抗生素诱导其产生耐药性，并用传统中药复方郁金散提取物及其组方药物成分共同诱导，研究此类中药对大肠杆菌耐药性的影响，进而筛选出能抑制大肠杆菌耐药性产生的1-2个单味中药成分及复方，为研发新药提供实验依据，并更好地为临床科学合理给药提供参考。

2.2 研究内容

（1） 确定大肠杆菌耐药株模型的建立方法，为耐药性的研究提供基础支撑。

（2） 比较复方和单味中药对大肠杆菌耐药性的抑制作用。

（3） 从郁金散提取物及其组方药物成分筛选出能抑制大肠杆菌耐药性产生的单味中药成分及复方。

2.3 拟解决的关键问题

本课题拟筛选出能抑制大肠杆菌耐药性产生的单味中药成分及复方，从而为临床防控本病提供有效的参考。

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

3.1 研究方法及试验方案

3.1.1 药液的制备

采用传统水煎法制备。将药物于10倍的蒸馏水中浸泡30min，急火煮沸后文火熬制60min，第二次加8倍量水，文火煎煮30min，第3次加6倍量水，文火煮沸30min，每次煎煮完均用8层纱布过滤。将3次熬制的中药液混合，过滤浓缩至相当于生药1g/mL,121℃高压灭菌15min，4℃冰箱保存。

3.1.2 材料的选择

3.1.2.1试验菌株的选择

选用大肠杆菌标准菌株。

3.1.2.2 药 品

抗菌药物：氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、庆大霉素、四环素、多西环素。

3.1.3 制备培养基

普通营养肉汤的制备：蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.5g，蒸馏水1000mL，将以上各物称好，加水煮沸溶解，调pH7.2~7.4，若pH高于7.6应用0.1mol/L HCL溶液调低，若pH低于7.2应用0.1mol/L NaOH溶液调高，121℃高压灭菌20min备用。

普通琼脂平板的制备：蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.5g，蒸馏水1000mL，按1.5%~2%加入琼脂，加热煮沸，调pH7.4~7.6，若pH高于7.6应用0.1mol/L HCL溶液调低，若pH低于7.2应用0.1mol/L NaOH溶液调高，121℃高压灭菌20min，待温度冷至45~50℃倒入平板备用。

MH肉汤的制备：称取MH肉汤干粉5g加入200mL蒸馏水溶解，分装于试管，高压灭菌后备用。

3.1.4 测最低抑菌浓度（MIC）

3.1.4.1 制备接种菌液

取测试菌用划线法涂布普通琼脂平板，35℃培养16~24h，挑取3~4个单个菌落，接种于4~5 mL肉汤培养基中，置于35℃培养箱中培养8~10h，用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含110⁸CFU/mL~210⁸CFU/ml。其稀释100倍至每毫升菌液含细菌110⁶CFU/ml~210⁶CFU/ml。

3.1.4.2 中药最低抑菌浓度（MIC）测定

将各种中药（包括单味中药和复方）稀释成终浓度为1g/mL的药液。采用试管二倍稀释法对试验菌株进行MIC试验。即取12支无菌试管编号，1~11号无菌试管各加入110⁶ CFU/mL菌液1mL，取1mL原药液置于第1号试管中，均匀混合，继而吸取1mL加入第2号试管内，依次类推稀释至10号管，弃去1mL，第11号管作为不加药液的菌液对照管，第12号管只加药液1mL作为不加菌悬液的中药对照管。摇匀后置于37℃恒温箱中培养16~24h后观察结果。在标准质控菌株的最低抑菌浓度符合规定范围的前提下，以无菌生长的最低抗菌药物溶液的浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

3.1.4.3 抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）测定

抗菌药物贮存液浓度不应低于1000mg/mL，取1280 mg/mL。采用试管二倍稀释法对试验菌株进行MIC试验。即取13支无菌试管编号，除第1管加入1.6mL MH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1mL，在第1管加入抗菌药物原液（如1280 mg/mL）0.4mL混匀，然后吸取1mL至第2管，混匀后再吸取1mL至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1mL弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1mL，使每管最终菌液浓度约为5105CFU/mL。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125 mg/mL。摇匀后置于37℃恒温箱中培养16~24h后观察结果。在标准质控菌株的最低抑菌浓度符合规定范围的前提下，以无菌生长的最低抗菌药物溶液的浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

3.1.5 人工构建大肠杆菌耐药株

分为试验组，对照组，空白对照组进行试验。每组均做3次重复。

试验组的处理方法为：取无菌试管编号，并于同一试管中配制低于最低抑菌浓度的中药和抗生素，挑取大肠杆菌于各药液中，摇匀后置于37℃恒温箱中培养16~24h，继续传代培养。

对照组的处理方法为：取无菌试管编号，于试管中配制低于最低抑菌浓度的抗生素，挑取大肠杆菌于各药液中，摇匀后置于37℃恒温箱中培养16~24h，继续传代培养。

空白对照组的处理方法为：取无菌试管编号，挑取大肠杆菌于各试管中，摇匀后置于37℃恒温箱中培养16~24h，继续传代培养。

3.1.6 耐药性的检测

3.1.6.1 抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）测定

测定方法如3.1.4.3。

3.1.6.2 药敏试验

（1）接种菌液的制备：用接种环于营养琼脂培养基上挑取分离纯化的大肠杆菌菌落4~5个，接种于3 ~5mL LB液体培养基中。37℃培养12h，用生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相同的浓度。

（2）菌液接种：用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后均匀涂布于MH琼脂平板上，在室温下干燥5min等待平板表面稍微干燥。

（3）贴药敏片：用镊子蘸取95%乙醇并通过火焰，待烧干后再蘸取乙醇重复上述操作，共三次。待冷却后，用此无菌镊子夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，即9cm平皿最多只能贴7张纸片，6张均匀地贴在距平皿边缘15mm处，一张位于中心，平皿做好标记。

（4）培养：将贴好药敏片的平板倒置于37℃恒温箱培养18~24h。

（5）结果判读：用游标卡尺测定不同抗菌药物对菌株的抑菌圈直径。根据美国临床实验室标准化协会（CLSI2012）规定的标准来判定药物敏感性。观察结果。

3.2 技术路线图

3.3 可行性分析

（1）利用现有的成熟理论知识以及成熟的实验方法，进行创新性的实验设计，试验方案简洁明了，可操作性极强。

（2）试验者具有一定的微生物学和中兽医学理论及试验基础，并具有吃苦耐劳的精神。