1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题的意义：禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，该病毒可引起的禽类高度接触性传染病，也可侵染多种宿主，包括人在内的各种动物如猪、马、哺乳动物。根据禽流感病毒致病性的不同,可分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。高致病性禽流感具有很高的传染性和致死性，低致病性禽流感也可以给养禽业和哺乳动物带来损害。目前，我国的低致病性禽流感疫情以H9N2亚型禽流感为主。自从1994年我国首次报道鸡群中分离到H9N2亚型禽流感病毒以来[1]，后续研究中发现H9N2亚型禽流感病毒在我国广泛存在，该病毒给禽类带来的直接危害是产蛋量下降，而且还会与其他病原共同感染导致禽类大量死亡；与此同时，国内在2003、2018年分别发现了H9N2亚型禽流感病毒感染人的案例[2][3]。
H9N2亚型禽流感病毒感为单股负链的RNA病毒，基因组分为8个节段，导致禽流感病毒抗原变异的原因有很多，比如禽流感的RNA聚合酶没有校正功能，所以在复制过程中会出现差错；比如免疫压力也会筛选出变异株[4]；再比如糖基化位点的变异也会导致抗原变异[5]。抗原变异最直接的影响就是免疫失败，这会给H9N2亚型禽流感的防控带来极大的困难。
近年来，采用反向遗传操作技术以提高毒株在鸡胚的复制效率，所以在在流感疫苗研究领域该技术已被广泛应用。采用反向遗传操作技术，通过简单的cDNA 克隆、转染等常规技术，我们能迅速得到重组毒株。通过对H9N2亚型禽流感抗原变异毒株反向遗传系统的建立，可以深入研究该病毒感染力和致病力的分子机制，为预测流感的大流行提供依据。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标：利用实验室采集到的病毒，增殖与纯化H9N2亚型禽流感抗原变异毒株；构建重组质粒所用的上下游引物均根据相应基因的特异性序列设计；病毒RNA的提取及该病毒基因的扩增；连接、转化、阳性质粒的筛选；PR8内部基因重组质粒的构建与鉴定；重组病毒的拯救与十二质粒反向遗传操作系统的验证；对毒株生物学活性的验证并完善该反向遗传平台。
研究内容
（1）利用H9N2亚型禽流感抗原变异毒株，在SPF鸡胚上纯化增殖。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1.病毒的纯化以及细胞的培养
用实验室保存的H9N2亚型禽流感抗原变异毒株在SPF鸡胚上纯化与增殖，分装，-70℃保存；293T细胞在血清、37℃、CO2培养箱中进行培养。
4. 研究创新点
特色或创新之处：
H9N2亚型禽流感病毒在我国广泛存在，该病毒给禽类带来的直接危害是产蛋量下降，而且还会与其他病原共同感染导致禽类大量死亡；不仅如此，H9N2亚型禽流感病毒也发生了感染人的案例。在我国，对H9N2的研究还比较常见，但关于H9N2亚型禽流感病毒变异毒株的相对来说比较少，该实验利用实验室平台，通过对H9N2亚型禽流感病毒变异毒株反向遗传平台的构建，可以进一步对该变异病毒的致病机理和理化特性进行系统分析。通过以上，可以更好的应对因为抗原变异而导致的免疫失败以及流行病学的监测。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2020.4.1-2020.4.15 查阅相关资料，做好前期准备
2020.4.15-2020.5.15 实验室进行试验以及相关数据测定
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