1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
在集约化养殖中母猪繁殖障碍会造成巨大的经济损失。母猪繁殖障碍主要指由感染性因素或非感染性因素导致母猪出现产死胎、木乃伊胎、胚胎死亡、不育（SMEDI）或弱仔、少仔的症状。而临床上最常见的病毒感染即猪伪狂犬病毒(Pseudoerabies,PRV)、猪细小病毒(Pcine parvovirus,PPV)、猪圆环病毒(Pcine circovirus,PCV)的感染或混合感染。除此以外还有蓝耳病毒、猪瘟病毒、乙脑病毒等病毒性感染和大肠杆菌等细菌感染均可引起母猪繁殖障碍。因此建立出高效、特异性好、快速的诊断方法十分重要。临床常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、病毒中和（VN）实验、乳胶凝集试验（LAT）、免疫组化、聚合酶链式反应（PCR）等，其中以PCR检测方法应用最广。TaqMan-qPCR检测方法具有重复性好、特异性强、灵敏性高、可实时定量分析、线性范围宽等特点；而多重PCR具有灵敏快捷、低成本、适合大规模检测等优点，在临床上用于多种病原混合感染的检测，尤其是能引起相同或类似临床症状的病原。在PRV、PPV和PCV混合感染方面，也有建立相关的多重PCR检测方法的报导。无论是哪一种PCR方法，其特异性和灵敏性主要由引物和探针的特异性决定。故设计出特异性好质量高的引物和探针是PCR检测方法中的关键一步。引物和探针的设计多依赖于国内外生物科技公司提供的设计服务，或者国内外的一些引物设计软件，故本课题在技术支持方面可以得到保障；而关键在于如何分析引物质量，判读引物分析结果。
本课题拟初步建立PRV、PCV、PPV的多重TaqMan-qPCR检测方法；分别选择PRV、PCV和PPV的gE、ORF1和NS1基因作为目的基因来设计引物来建立多重TaqMan-qPCR检测方法。该方法综合了TaqMan-qPCR和多重PCR的优点，具有特异性强、灵敏性高、可实时定量分析、经济快捷等特点，在临床上为病原检测、流行病学调查和监测等提供技术支持。
TaqMan水解探针技术最早在1991年由Cetus公司的Holl等[使用，此之后，Heid等于1996年首先报道了TaqMan PCR的原理和方法，同年，ABI公司推出5’端标记荧光基团3’端标记淬灭剂只能结合靶模板的TaqMan探针。研究发现，TaqMan探针法的灵敏度比普通PCR高一个数量级，且不易产生因与污染核酸结合而产生的假阳性。在国内外TaqMan探针法在医学和分子生物学领域已经得到了广泛应用。目前国内的动物医学领域也逐渐出现应用TaqMan-qPCR检测各病原的相关文献报导。如赵丽等人建立Taq-Man实时定量荧光PCR检测猪伪狂犬病毒；石林等人根据PCV2的ORF1基因序列设计合成特异性引物和探针构建并优化TaqMan荧光定量PCR反应条件；李晓菲等人根据猪圆环病毒基因序列设计特异性引物建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB 荧光定量 PCR方法等。除此以外，国内也有建立相关的多重PCR检测方法的报导。如辛长勋等人分别针对PCV2的Rep基因、PPV的NS1基因、PRV的gE基因设计3对特异性引物，通过优化，建立了可同时检测PCV2、PPV及PRV三种病毒的多重PCR方法。在蔺芳的研究中，建立了对PPV、PCV2、PRV疫苗毒和野毒的四重PCR检测方法，其参照GenBank进行序列比对，选择相对保守的基因序列（其中PRV疫苗毒和野毒选择gB和gE基因）设计特异性引物。李春燕参照GenBank进行序列比对，选择相对保守的PPV、PRV及PCV2基因序列设计3对特异性引物，建立三重PCR方法。在刘志杰等人的研究中，针对引起猪繁殖障碍的六种主要病毒性病原（PRV、PPV、PCV、PRRSV、CSEV、JEV）建立多重PCR检测方法，其中选择PCV2的ORF2基因、PPV的NS1基因、PRV的gE基因作为目的基因设计引物。在刘志杰等人的研究中，针对引起猪繁殖障碍的六种主要病毒性病原（PRV、PPV、PCV、PRRSV、CSEV、JEV）建立多重PCR检测方法，其中选择PCV2的ORF2基因、PPV的NS1基因、PRV的gE基因作为目的基因设计引物。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
寻找PRV、PPV和PCV的保守基因作为目的基因来设计特异性引物来建立多重TaqMan-qPCR检测方法，并检验引物的特异性及质量，同时进行多重引物分析。
2.内容
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
前期通过文献研究法对现有国内外相关技术进行归纳总结，掌握病原基因的基本信息；主要通过软件设计并分析引物和探针
2.技术路线
4. 研究创新点
本课题分别选择PRV、PCV和PPV的gE、ORF1和NS1基因作为目的基因来设计引物来建立TaqMan-qPCR检测方法。这三种基因分别是三种病毒的保守基因，在每个病毒的不同基因型毒株之间保有最大的同源性。故根据三种保守基因设计的引物可以保证不同病毒之间的检测特异性，而不区分病毒的基因型，这为临床提供了诊断及治疗依据。
5. 研究计划与进展
1.2020年2月下旬：课题相关文献资料搜集整理；外文文献翻译
2.2020年3月-3月中旬：完成文献综述
4.2020年3月下旬：明确研究流程
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