1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
捻转血矛线虫病是一种在全球范围内流行十分广泛的胃肠道吸血型寄生虫病，属于毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)[1]，常见于小反刍兽的感染，对我国的养羊业危害巨大。该寄生虫病常于春季爆发，一个方面，感染性幼虫的活动与温度，湿度以及光照强度相关，具有较强的抗逆性，能够在冬季外部环境恶劣时钻入土壤进行躲避，并在第二年春天重新爬上牧草顶端，在羊群采食牧草时进入羊的体内感染羊群。另一方面，经过寒冷的冬季，由于草料的摄入减少，羊群体抗力整体降低，存在于体内的幼虫就会开始发育，春季就会在动物体内出现大量成虫，引起羊群大规模发病。捻转血矛线虫靠吸食宿主的血液为生，虫体普遍寄生于羊的第四胃上，引起肠胃道的出血和炎症反应。一般来说，一只发病羊体内，大约有上千条虫体寄生在第四胃黏膜上。宿主体内虫体达2000条时，这些寄生虫每天能够吸取宿主30mL的血液[2]，可能导致宿主的急慢性贫血，水肿，严重的腹泻，体虚，虫体还会产生毒素，阻碍机体造血功能发挥作用，造成消化系统的分泌失调，影响饲料的消化吸收等，使羊群体重减少，甚至发生死亡，对养殖户造成巨大的经济损失。
捻转血矛线虫病的控制主要依靠准确高效的检测手段，检测到感染的时间越早，该病就越容易得到控制。因此，一个行之有效的早期诊断手段是亟需被建立的，粪便虫卵计数法是临床上检测该疾病的主要方法，通常在感染3-4周后可以在粪便中检测到虫卵，然而此时虫体已形成了牢固感染，并且已经造成了经济损失[3]。尸体剖检也是很可靠的诊断手段，确诊病例可在第四胃胃壁，十二指肠肠壁上发现数以千计的浅红色，1-2cm长的头发丝状虫体，并在第四胃黏膜层可见卡他性炎症，伴有溃疡斑及针尖状出血点，前胸部和下颌间有胶冻样水肿，胸腹腔有大量淡黄色积液，血液稀薄颜色较淡且不易凝固，肌肉苍白，肠系膜苍白呈胶冻样，伴有粘性水肿[4]，检测准确率极高，但在出现死亡病例后进行尸体剖检，羊群此时往往已造成大规模感染，这时候再对疾病进行控制效果并不显著。
Ian G. Colditz等[5]研究发现感染捻转血矛线虫的绵羊的失血量与其体内的捻转血矛线虫虫体数量以及产生的虫卵数量呈明显的线性关系，表明一旦确定感染，绵羊的失血量就与体内的虫体和虫卵数量建立了确定的相关关系，因此检测绵羊粪便中的血红蛋白或者其他血液制品可能成为评估感染水平的良好手段。此外，由于绵羊在感染捻转血矛线虫后的大约第11天开始出现大量失血，比粪便中感染3-4周可以检测出虫卵的时间要早，因此比粪便虫卵计数法更适用于早期诊断。Sara Ljungstrm等[6]比较了四种检验粪便内捻转血矛线虫虫卵的诊断方法，分别为McMaster 虫卵计数法，花生凝集素（Peanut Agglutinin ,PNA）染色的虫卵差异计数法， 检测扩增后DNA的实时定量聚合酶链反应技术 （Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction ,qPCR）以及环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification ,LAMP）。研究显示这四种不同的诊断方法的检测结果存在良好的一致性，qPCR技术和LAMP技术比上述两种基于显微镜检查的两种诊断方法敏感，尤其是qPCR技术对于捻转血矛线虫的检验更敏感，但McMaster虫卵计数法和PNA染色的虫卵差异计数法这两种诊断方法之间的差异性小于上述两种分子诊断技术。粪便中的生物成分种类繁多，虽然不同种类的虫卵存在大小，形状，颜色上的细小差异可以用于进行品种鉴定，但这需要大量专业的知识背景，以及熟练的操作技巧。有人认为，在常规的临床诊断背景下，通过粪便中虫卵来进行的形态学检查时不可行的。所以，专用于捻转血矛线虫虫卵染色的PNA染色法逐渐发展了起来，但该项荧光标记染色技术还没有在诊断试验中得到广泛的运用，因为该项检查技术需要配备先进的带有荧光灯的先进显微镜，并且PNA的染色技术十分的耗时耗力，检测样本需要大量的虫卵，也难以应用于批量的检测对象，因此PNA染色的虫卵差异计数法难以用于常规的诊断情境中，而且PNA染色计数在实验中存在一定的阴性率，精确度难以把控。对于两种分子诊断技术，qPCR技术和LAMP技术都有着较高的灵敏度，尤其是LAMP技术的敏感性比常规PCR技术高出了10倍，相比于qPCR需要的如PCR热循环器等较为复杂精密的仪器，LAMP更有应用于大规模诊断的前景，但因其发展较晚，技术手段尚不成熟。
2. 研究的基本内容和问题
此项研究旨在评估HcBLAODA蛋白应用于ELISA检测捻转血矛线虫的抗原的潜力。主演要对HcBLAODA蛋白作为检测抗原的特异性，及以该蛋白建立ELISA的可操作性。
3. 研究的方法与方案
在虫体中分离纯化得到目标蛋白质，确定抗原最佳包备浓度和血清最佳稀释浓度，确定酶标二抗最佳工作浓度和工作时间，确定ELISA的阴性阳性临界值，最后在进行敏感性，特异性，重复性试验。HcBLAODA蛋白在捻转血矛线虫虫体中普遍存在，交叉反应性低，具有良好的特异性，理论上该试验方案具有良好的可行性。
4. 研究创新点
以捻转血矛线虫虫体中特异性存在的蛋白质作为建立ELISA检测的抗原，不同于普遍使用的排泄分泌抗原，该抗原交叉反应性低，具有很好的特异性。
5. 研究计划与进展
附件：流程图
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