类胡萝卜素对小鼠肠道微生物的作用开题报告

 2023-02-19 20:25:09

1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)

近年来,由于我国经济社会的高速发展,居民生活方式及膳食结构的改变,人们的肠道菌群也随之发生变化,如果肠道菌群结构和数量变化超出了正常生理范围,便会造成肠道菌群失调,增大机体感染疾病的几率,对人体健康造成威胁。在畜禽的养殖生产中,也常常因抗生素的使用,日粮的变化,各方面的应激等造成肠道菌群失调,使得畜禽生理功能紊乱,无法健康发育生长,造成较大的经济损失。人体的肠道大概拥有10 14个细菌,约500-1000种,肠道基因组所包含的基因多达数百万,其中包含多个与物质代谢、免疫、信号相关的基因群体[1]。他们除了能够影响消化吸收能力,减少感染疾病的风险,还与多种代谢性和免疫性疾病存在相关性,如肠炎[2]、肝硬化[3]、肥胖[4]、糖尿病[5]、高尿酸血症[6]等。最近几十年,随着肠道菌群的分析检测技术不断在发展,人们已经发现肠道微生物在机体发育、免疫调节、肠道屏障、营养吸收等方面发挥着重大作用,肠道菌群对代谢性、免疫性等疾病之间的关系研究也取得了重大的进展,因此大量的研究开始聚焦在寻找一种安全、有效、无毒副作用的天然成分用于调控肠道微生物。而类胡萝卜素作为一种自然界广泛存在的具有多种生理活性的微量营养素,不仅具有良好的着色作用,还具有较强的抗氧化、清除自由基的作用,在提高机体免疫性能、抵抗外来应激方面亦发挥着重要作用。因此国内外专家学者开始研究类胡萝卜素对肠道微生物的作用,然而由于类胡萝卜素种类和作用繁多,对生物体的作用机制也颇为复杂,类胡萝卜素对肠道微生物组的作用仍不清楚,相关研究也鲜有报道。因此,我们认为非常有必要就类胡萝卜素对肠道微生物的作用影响进行研究,以期为预防和治疗肠道菌群失调引起的代谢性、免疫性等疾病提供理论依据。

类胡萝卜素是一类广泛存在于各种动植物及微生物体中的重要天然色素。自19世纪初分离出胡萝卜素以来,国内外专家学者从自然界分离并鉴定的类胡萝卜素超过1000种[7]。动物不能制造类胡萝卜素,只能通过摄食获取以用于自身的新陈代谢。天然类胡萝卜素本身具有的抗氧化[8]、增强免疫[9]、抑制肿瘤生长[10]等功能,对动物体健康具有积极的作用,因此广泛应用于饲料、食品和保健品中。早期便有研究报道[11],饮食中的类胡萝卜素可以预防维生素A缺乏症大鼠的肠道感染,但对于类胡萝卜素与肠道中微生物的关系并未进行深入研究。目前关于类胡萝卜素对肠道微生物的直接作用研究很少,最近Sun[12]等通过向饲料中添加富含类胡萝卜素的粘液性红假单胞菌发酵产物,对母鸡盲肠中微生物进行统计分析,发现这种发酵产物可以丰富母鸡盲肠菌群的活性和多样性,但并不确定是类胡萝卜素对肠道微生物产生了影响。Liu[13]等研究发现一种从裙带藻中提取出的叶黄素类类胡萝卜素岩藻黄质可以促进肠道中大肠杆菌和乳酸杆菌的生长,但对其作用机制并不清楚。类胡萝卜素作为动物体内的一种非酶型断裂性抗氧化剂[14],可以通过与活性氧自由基(ROS)反应生成无毒产物或者中断自由基的连锁反应来清除体内自由基[15],减少ROS对细胞遗传物质和细胞膜的损伤,阻止光氧化和脂质氧化[16]。乔艺[17]等人认为,ROS可能通过改变肠道环境中的氧分子含量,调整好氧菌与厌氧菌的丰度,来影响肠道菌群结构。Devkota[18]等研究发现,高脂膳食等原因产生的ROS会破坏肠道微环境,导致菌群结构失衡。因此类胡萝卜素完全可能通过自身良好的抗氧化性清除肠道ROS来间接对肠道微生物产生作用,维持肠道菌群的动态平衡。

由于机体的免疫系统与肠道微生物群组成密切相关,类胡萝卜素也很有可能通过调节机体免疫机能来作用于肠道微生物。IgA作为机体黏膜防御系统的主要成分,能够分层[19]、识别并包被特定微生物区系[20],减缓病菌繁殖。类胡萝卜素可通过调节IgA分泌改变肠道菌群。杨敏[21]研究了异源类胡萝卜素对雏鸡肠道的影响,发现日粮中添加类胡萝卜素的实验组雏鸡的小肠部分IgA分泌细胞数量明显高于空白对照组,营养消化吸收能力也有所增强,说明类胡萝卜素可以促进IgA分泌,增强肠道免疫。而IgA的增加会保证肠道内有益菌株如乳酸杆菌、双歧杆菌等的正常比例与数量[22],IgA分泌减少会使肠道丙型变形杆菌增多,双歧杆菌和乳杆菌减少,从而导致促炎细胞因子的产生增加[23]。但是类胡萝卜素对免疫的调控机制复杂,通过调控IgA的分泌来改变肠道菌群还有大量疑问,相关报道极为少见。

虾青素作为类胡萝卜素家族中的一员,属于酮式非维生素A原类胡萝卜素。目前,天然虾青素已被毒理学试验证实是安全且生物可利用的化合物,在欧洲、日本和美国已经广泛使用虾青素产品作为膳食补充剂[24]。虾青素由于其卓越的抗氧化能力和优秀的免疫增强能力,对肠道微生物的调控作用相对其他类胡萝卜素可能更加明显。近年便有研究表明虾青素可以影响肠道微生物来防治一些疾病。例如倪晓锋[25]研究发现虾青素(100mg/kg)可以通过抑制前列腺移植瘤裸鼠肠道中Lactobacillus菌种数量的增长而达到抑制肿瘤增长的目的。Wangle[26]等通过对高脂小鼠肠道厚壁菌与拟杆菌的比例(影响卡路里吸收进而改变体重的指标)统计分析发现,虾青素可以降低这个比例,并且通过减缓疣微杆菌门的Akk菌(瘦细菌)含量的下降,而减缓肥胖趋势。Liu[27]也报道了虾青素可增加患有酒精性脂肪肝疾病的小鼠的Akk菌并预防酒精性脂肪肝疾病。Gao[28]等人研究发现虾青素可增加高脂高蔗糖饮食小鼠肠道中Oscillospira属和Dehalobacterium的丰度,对治疗一些炎症性疾病具有积极的作用。由此可见虾青素相比其他类胡萝卜素,对肠道微生物的具有更广泛的调控作用。 然而,目前关于虾青素对肠道微生物的直接作用研究报道仍比较少,已有的研究也大都是针对相应的疾病进行的部分肠道微生物分析,这些研究对类胡萝卜素影响肠道微生物的作用还远远没有搞清楚。因此我们认为非常有必要系统全面的研究类胡萝卜素对肠道微生物的作用。 为了进一步研究类胡萝卜素对肠道微生物的作用。本课题拟以虾青素为研究材料,采用C57BL /6J小鼠为动物模型,利用16s rRNA 扩增子测序的技术手段,对小鼠盲肠微生物进行DNA提取、扩增及测序,通过生物信息学及统计分析,评估虾青素对小鼠肠道微菌群组成和丰度的影响,研究类胡萝卜素(虾青素)对小鼠肠道微生物的作用。通过该课题的实施,阐明类胡萝卜素(虾青素)对小鼠肠道微生物的作用,为肠道菌群失调引起的代谢性、免疫性疾病的研究提供科学的实验依据,对今后类胡萝卜素尤其是虾青素在食品、保健品与药品上的应用具有重要贡献。

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2. 研究的基本内容和问题

1.1课题研究目标

本课题拟以虾青素为研究材料,首先对C57BL/6J小鼠喂养虾青素添加的饲料,然后收集盲肠内容物,对其中微生物DNA进行提取、纯化,利用16s rRNA扩增子测序的技术手段,对纯化后的细菌基因组DNA进行扩增及测序,通过生物信息学及统计分析,评估虾青素对小鼠盲肠菌群组成和丰度的影响。本课题研究结果有助于阐明类胡萝卜素(虾青素)对小鼠肠道微生物的作用,为肠道菌群失调导致的代谢性、免疫性疾病的研究提供科学的实验依据,为类胡萝卜素在食品、保健品和药品市场上的开发奠定基础。

1.2课题研究的内容

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3. 研究的方法与方案

2.1 研究方案及方法

2.1.1虾青素对肠道微生物的作用研究

以C57BL /6J小鼠为实验动物模型,将其雌雄分开,分别进行分组研究。将0.04g/kg虾青素与饲料充分混匀,进行饲喂,并设立相应对照。将其处于正常饲喂状态,四周后开展以下研究工作:

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4. 研究创新点

3.本课题的创新之处

通过饲喂,使虾青素直接作用于小鼠肠道微生物,研究虾青素对肠道菌群在门、属、种分类水平上的影响。

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5. 研究计划与进展

4.课题研究计划及预期进展第一阶段 (2020.3.10—2020.3.25): 申报课题,收集专业文献综述,设计实验思路,提交开题报告第二阶段 (2020.3.25—2020.4.30): 进行动物实验部分,搜集粪道及肠道内容物样品第三阶段 (2020.5.01—2020.5.20): 小鼠粪便DNA和肠道DNA提取并进行16S rRNA基因扩增。

对纯化的DNA定量、测序,并对测序结果进行数据处理,分析得出结论第四阶段 (2020.5.20—2020.6.10): 研究工作总结及论文撰写

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