si:dkey-28n18.9基因在斑马鱼中发育过程中的表达分析及其与血管生成的关系开题报告

1.1 Snx32基因的简介

斑马鱼si:dkey-28n18.9基因在血管内皮细胞表达，但其具体的细胞生物学功能及缺失后的细胞表型的尚未见报道。ensembl数据库中，给出该基因与小鼠的snx32基因具有同源性，故我们将基于snx32的表达特点及功能，结合si:dkey-28n18.9的时空表达特点与血管发育过程，揭示si:dkey-28n18.9在血管发育中的生物学作用。

SNXs（Sorting nexins）是一个外围膜蛋白家族。1996年，Gordon Gill从酵母双杂交筛选中分离出哺乳动物SNX1，旨在识别与表皮生长因子受体（EGFR）结合的蛋白质。然而，直到2001年发现PX结构域，这个家族才真正开始成长。PX结构域是磷酸肌醇结合基序。PX结构域是脂质结合模块，有助于其宿主蛋白与富含特定磷脂酰肌醇的膜结合。在许多情况下，PX结构域已被证明与磷脂酰肌醇3-单磷酸（PtdIns3P）结合，这是一种富集于内体细胞溶质表面的磷脂酰肌醇。这种脂质在多种分类过程中具有调节功能，确保货物在内吞和生物合成途径之间的正确分配。[1]

SNXs是一大类不同的细胞运输蛋白，在酵母和哺乳动物中分别被鉴定出了10个和33个成员。根据其骨架、酶和调节结构域的构成方式，这些成员被分为不同的亚家族。它们都有一个共同的phox同源（PX）结构域，与细胞器膜中的磷脂酰肌醇（PI）脂质结合。许多SNX家族成员还包含其他各种保守的结构域，BAR和FERM域是较普遍的。[2]

1.1.1 SNX32基因的结构

人的Snx32（sorting nexin 32）位于人的染色体11q13.1，全长1681nt，由15个外显子构成。Snx32是SNXs蛋白质大家族里亚家族SNX-BARs的一员。SNX-BARs有12个成员，包含Snx1、Snx2、Snx4、Snx5、Snx6、Snx7、Snx8、Snx9、Snx18、Snx30、Snx32和Snx33[3]。已有的研究信息显示，一些SNX-BARs定位于整个内吞网络中的管状和囊泡膜的刨面，并被描述为参与网络依赖性和非依赖性内吞作用，以及越来越多的内吞体分类事件。典型的PX结构域由三股β-片（β1、β2和β3）和三个紧密排列的α-螺旋组成。第一个和第二个α-螺旋由一个延伸的富含脯氨酸的序列连接。通常，已经发现PX结构域通过β3链、α1螺旋和富含Pro的环之间的连接处形成的碱性口袋与富含内切体的磷脂酰肌醇-3-磷酸（PtdIns3P）结合。相比之下，SNX5、SNX6和SNX32在PtdIns3P结合袋中具有主要的改变，从而排除了典型的脂质头群对接。此外，它们在Pro-rich环和未知功能的a2螺旋之间具有独特的延伸螺旋-转螺旋插入[4]

1.1.2 SNX32基因现有功能的研究进展

SNX-BAR蛋白包含一个额外的BAR（Bin/Amphiphysin/Rvs）结构域，可以感知膜弯曲并诱导膜微管化。BAR结构域是一个二聚体，形成一个刚性的杯状结构。这允许杆区引起膜变形，将扁平膜转变为管状膜表面[5]。目前的模型提出，PX和BAR结构域必须与膜结合，以确保特异性和有效结合。许多SNX-BAR蛋白（SNX1、SNX2、SNX5、SNX6和神经元SNX32）形成异二聚体复合物。这些对于内体到TGN的回收和内体到质膜的循环至关重要[5]。目前的模型表明，SNX-BAR与SNX27和反转录体的关联有助于内体到质膜的循环，SNX27的PDZ结构域是主要的货物识别模块[6]。最后，SNX-BAR蛋白在自噬过程中具有反转录体独立的作用。

反转录体是一种进化保守的蛋白质复合物，哺乳动物转运识别复合物包含与酵母反转录体的紧密同源物：Vps26、Vps29和Vps35。斑马鱼，小鼠和人类细胞可以包含至少四种不同的SNX-BAR二聚体变体，它们由SNX1或SNX2组成，与SNX5或SNX6相关。目前尚不清楚SNX32是否也是逆转录酶复合物的一部分，它与SNX6具有高度的序列相似性。[3]

全基因组关联研究（GWASs）发现了许多单核苷酸多态性（SNPs）与乳腺癌风险的微小增加有关。迄今为止的研究表明，一些单核苷酸多态性改变了相关基因的表达，这可能会介导风险修饰。Na Li等在此基础上假设其中一些基因可能因罕见的编码变异而富集，这些变异与更高的乳腺癌风险有关。通过对病例的研究分析，对LoF（功能缺失）变体过量贡献最大的基因包括TET2、NRIP1、RAD51B和SNX32，而ZNF283和CASP8对错义变体过量贡献很大。[7]

Nelson K. Kibinge等研究显示，基因为治疗靶点以降低阿尔茨海默病风险会对其他结果产生相反的影响，如高密度脂蛋白胆固醇水平和体脂百分比。有必要对这一目标进行进一步评估，以确定阿尔茨海默病风险增加的遗传易感性是否是这些预测效应（例如，较低的肥胖）的原因。或者，该位点的基因变异可能会通过其他生物途径（也称为“水平多效性”）分别影响这些结果，这可能会降低SNX32作为治靶点的吸引力。[8]

1.2斑马鱼基因表达的研究方法

迄今为止，在所有已经完成序列测定的脊椎动物中，斑马鱼的基因组序列最大，其基因组中包含了超过26000个编码蛋白质的基因。斑马鱼的器官形成过程于人类非常相似，并且斑马鱼的基因和人类的基因之间有着87%的高度同源性。斑马鱼成鱼每次可产下300～600颗胚胎，胚胎的发育速度非常快，短时间内即可观察到早期发育的整个过程，所以非常适宜于研究各个发育阶段的特点。斑马鱼的胚胎是透明的，易于在显微镜下直接观察和操作。与其它脊椎动物相比较，斑马鱼的疾病表型往往可以简单地通过光学显微镜观察其胚胎的光透明度来判定，或者进一步通过驱动特定组织和器官中荧光蛋白的表达来确定，因而大大降低了表型筛查的难度。[9]

1.2.1 mRNA水平的表达谱分析

研究mRNA水平的基因表达谱分析常用的方法有Northern blot、原位杂交、RT-PCR等。Northern blot可对基因进行特异和定量的检测，但测定效率不高，灵敏度也低,不能检出微小的基因表达量,同时实验中使用的放射性物质对人和环境也有危害。作为一种经典的基因表达量分析方法,Northern blot依然被广泛地应用。原位杂交技术由美国耶鲁大学Gall和Pardue于1969年首先创立，广泛用于检测一个特异的mRNA在某一种生物体或者组织、细胞里的具体表达位置,对待测核酸分子进行定性、定量及定位分析。RT-PCR主要有半定量RT-PCR、实时定量RT-PCR以及竞争性定量RT-PCR:半定量RT-PCR操作简便、快捷,但精确度不高,多用于快速初步分析;实时定量RT-PCR是近年来新发展起来的,特异性强、自动化程度高;竞争性RT-PCR则是将特异性的目的序列同已知浓度的内标RNA一起扩增。通过比较由内标获得的信号和目的模板所获得的信号，确定目的模板的相对含量。[10]

1.2.1.1 Northern印迹法

Northern印迹法是经典的方法，用于检测特异性的RNA。 首先将RNA混合物按照它们分子量的大小通过变性琼脂糖凝胶电泳加以分离，分离出来的RNA被转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，用同位素或酶标记的DNA探针与固定的RNA进行杂交，探针通过配对仅与特异性的RNA结合。通过放射自显影或酶促颜色可检测杂交RNA的大小和密度，利用光密度计或磷光显象仪可以对结合的RNA总量进行定量分析[11]

1.2.1.2 RT-PCR

分别提取胎龄不同的全胚胎，将所有组织的总RNA，用逆转录试剂盒反转录以获得cDNA模板。通过PCR技术对Snx32基因在胚胎各个发育阶段的表达进行定量分析。全胚胎测序定量分析可以检测出胚胎在不同年龄时Snx32的总表达量，实验操作流程相对简便，但是不能特异性分析出不同组织内基因的表达情况。

RNA转化成cDNA的量会影响RT-PCR产物的量，由于PCR呈指数增长的特点，样品间很小的差异会被转化成产物量间很大的差异;另外，绘制定量工作曲线时，PCR反应条件的优化很费时。目前RT-PCR法主要用于检测样品量有限时(如活组织切片样本)的RNA表达量，或用于mRNA含量很低的情况。由于内标法操作繁琐，该法只适用于测定少数样本。[11]

1.2.1.3斑马鱼全时相原位杂交

选取不同胎龄时间周期的野生型斑马鱼胚胎进行WISH(wholemountinsituhybridization，全胚胎原位杂交技术)，用l×PBST溶液洗去固定液，不同浓度的甲醇进行梯度脱水后，胚胎预杂交，加反义mRNA探针杂交，用缓冲液洗去过多的探针，加入地高辛抗体后过夜，再用缓冲液洗去过多的抗体，加入染液进行染色，用固定液对杂交胚胎进行固定并照相，记录结果[12]。全胚胎原位杂交可以检测出胚胎不同时间段不同组织内Snx32基因的表达量，同时可以通过显色技术清晰地看到表达部位，但是实验操作比较复杂，实验周期长。

1.2.1.4单细胞测序技术

所谓的单细胞测序技术，其本质是将单个细胞的全部或者经过处理的核酸分子(DNA和/或RNA)通过测序方法测序(一代测序、二代测序、三代测序),进而利用生物信息学和统计学对其进行描述和分析。单细胞测序的发展基于测序技术发展而来。第一代测序技术，即Sanger测序法，是1977年由Frederick Sanger及其同事开发，通过对单一核酸分子逐个碱基标定进而达到测序目的。利用Sanger测序法，人类基因组计划于2003年得以完成，初步绘制了人类基因组序列的草图，为生命解码奠定了坚实基础。为了进一步提高测序通量和测序速度，2000年开发了二代测序技术(高通量并行测序)。二代测序技术的成熟发展和广泛应用，使得测序费用按照摩尔定律不断下降，并且起始DNA、RNA量的需求不断降低(从μg至pg水平)。第1个在单细胞中进行二代测序的尝试，是2009年TANG等利用小鼠胚胎细胞绘制了单细胞水平的转录组变化，并在此基础上发展出了SMART-seq2、Drop-seq、Microwell-seq、SPLiT-seq以及目前广泛商业化应用的10×Genomics等单细胞转录组测序技术。在单细胞基因组测序方向，2012年，谢晓亮团队开发出了单细胞全基因组均匀扩增的新方法——多重退火循环扩增法(MALBAC)，奠定和促进了单细胞水平基因组学的发展。而在单细胞表观遗传学测序方向，2015年，有研究报道了检测单细胞水平染色质可及性、组蛋白修饰等的scDNase-seq、scATAC-seq、scChIP-seq等技术。近年来，单细胞表观组学的新方法又不断开发，解决了scDNase-seq等技术细胞通量低的问题，以及联合多个组学的多组学单细胞测序技。这些单细胞技术的不断开发和应用，为细胞解码等大科学计划铺平了道路。[13]

1.2.2蛋白质水平的表达谱分析

蛋白质水平上的表达分析的常用技术是Western blot和免疫组化等。Western blot与Nortern blot类似,不仅可以进行定量分析,而且还能够检测蛋白质的分子质量大小及其聚体形式。免疫组化是研究细胞内蛋白质定位、定量的重要方法,特异性强、敏感性高、能够准确确定蛋白质是在特定组织中的哪些细胞以及在特定细胞的哪个部位中表达。

1.2.2.1免疫印迹法

免疫印迹法（Western Blot）是一种将凝胶电泳和免疫化学分析相结合的杂交技术，是实验室中检测蛋白质表达与分布的最常用的一项分子生物学技术。将生长于细胞培养皿中的细胞用预冷的1×PBS洗涤，细胞重悬细胞裂解液中，临用前加入蛋白酶抑制剂，冰浴，用涡旋振荡充分混匀细胞，使蛋白充分裂解。离心收集裂解液上清，再用Bradford法进行蛋白定量。取样进行SDS-PAGE，电转移至PVDF膜上，应用抗体孵育并与相应的二抗反应，化学发光法检测抗原抗体结合区条带，用软件对光密度值进行定量，对不同分子量的蛋白表达情况进行分析[14]。使用WB分析可以准确识别出细胞内蛋白的表达量和分布位置，但是不同的裂解液会对检测结果产生影响，使灵敏度和分辨率降低。

1.2.2.2组织切片及免疫荧光或免疫组化

将需要检测的组织用常规方法制备石蜡切片。将组织切片处理后修复抗原。将制备的血清加于组织切片，再加入标记的抗体（二抗），孵育后PBS冲洗，加入甘油／PBS(1:1)溶液，置荧光显微镜下观察。同时设置对照试验[15]组织切片后免疫荧光检测能够清晰地观察到组织内部基因的表达情况，同时免疫荧光检测的特异性很好，灵敏度较高，但是前期准备较为复杂，需要准备单因子血清和特异性荧光标记抗体。

1.3本研究的目的和意义

根据现有对SNX-BARs的研究，Snx32极可能具有磷脂酰肌醇结合活性，并参与从内体到高尔基体逆行运输。故将通过原位杂交实验，考察其在胚胎发育过程的表达谱，并分析其与血管发育的影响。

参考文献

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