氯化铵甘草口服溶液等三种常见医院自制制剂的微生物检查方法验证开题报告

1. 研究目的与意义

药品的安全性是药品在临床应用的重要前提及必要保证，也是优先于药品有效性、经济性的重要因素。药品的微生物检查是确保药品安全性的重要保障之一。近年来，我国由于药品的微生物控制不严格导致的药品质量问题层出不穷，从欣弗事件到刺五加注射事件，从2007年的丙种球蛋白事件到2016年的山东毒疫苗事件，药品微生物污染给人民群众的健康带来了巨大的威胁。

氯化铵甘草口服溶液、复方薄荷脑滴鼻液、硼酸醇滴耳液是三种常见医院自制制剂，分别为中国药典的口服溶液剂、滴鼻剂和滴耳剂。由于历史的原因，我国医院自制制剂的质量标准往往低于同期的药典标准，因此给自制制剂的质量控制带来了较大的隐患。

这三种自制制剂在质量控制方面与现行的药典存在着较大的差异，存在脱节现象，但这三种医院自制制剂临床疗效确切，使用安全，用量较大，是医院中所不可或缺的。所以，按照新版药典要求做好这三种常用的自制制剂的微生物控制，对于保障临床用药安全具有重要的意义。

2. 文献综述

氯化铵甘草口服溶液等三种常见医院自制制剂的微生物检查方法验证

南京中医药大学翰林学院 药学140201101 费银怡

3. 设计方案和技术路线

研究方案：

本课题以三种医院自制制剂：氯化铵甘草口服溶液、复方薄荷脑滴鼻液和硼酸醇滴耳液为研究对象，考察拟确定的微生物检验方法（按照2015版药典重新设计）检查微生物限度的可行性是否符合要求。研究拟分两个方面展开：第一个方面为需氧菌总数、真菌和酵母菌总数计量方法的验证，采用平皿计数法，考察在设定的实验条件下，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种菌的计数回收率是否合格；第二个方面为控制菌的检查，考察在设定的实验条件下三种制剂种对应的控制菌是否可以专属性的、正确的检验出，对于氯化铵甘草口服溶液，检查的控制菌为大肠埃希菌，对于复方薄荷脑滴鼻液和硼酸醇滴耳液，检查的控制菌为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

研究技术路线：

本课题拟按照以下4步技术路线来完成实验研究：

第一步，确定微生物检验方法的具体参数，包括取样量，稀释液体积、种类，培养温度，培养时间，稀释级数，培养基种类、用量等。

第二步，按照第一步选定的参数，采用平皿计数法，考察铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌三种药典规定的标准细菌菌株在拟采用的检验方法下的平均回收率。

第三步，按照第一步选定的参数，采用平皿计数法，考察白色念珠菌、黑曲霉2种药典规定的标准真菌菌株在拟采用的检验方法下的平均回收率。

第四步，按照第一步选定的参数，采用菌落形态和显微形态鉴定的方法，验证拟采用的控制菌检查法是否能专属的、准确的检查出控制菌。

研究具体步骤：

1.标准菌株的准备

按照2015版中国药典要求准备以下5种菌株

（1）大肠埃希菌（Escherichia coli）

编号：___________________ 保存条件：__________________

（2）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

编号：___________________ 保存条件：__________________

（3）枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

编号：___________________ 保存条件：__________________

（4）白色念珠菌(Candida albicans)

编号:___________________ 保存条件：__________________

（5）黑曲霉(Aspergillus niger)

编号: __________________ 保存条件：__________________

以上5种标准菌株均要求为5代以内的传代培养菌株。

2.培养基的制备

（1）胰酪大豆胨琼脂培养基的制备

取40.0g胰酪大豆胨琼脂培养基干粉 ,加热搅拌溶解于 1000ml 纯化水中,分装三角瓶,121℃高压灭菌 15 分钟,备用。

（2）胰酪大豆胨液体培养基的制备

称取30.0g胰酪大豆胨液体培养基干粉，加热搅拌溶解于1000ml纯化水中，分装于试管或其他的容器中，121℃高压灭菌15min，备用。

（3）沙氏葡萄糖琼脂培养基的制备

称取 65.0g沙氏葡萄糖琼脂培养基干粉,加热搅拌溶解于 1000ml 纯化水中,121℃高压灭菌 15 分钟,冷却至 50℃左右时,倾入无菌平皿,备用 。

（4）溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的制备

取营养琼脂培养基40.0g、溴化十六烷基三甲铵0.3g,加热溶于1000ml 纯化水中,121℃高压灭菌 15 分钟，冷却后倾入无菌平皿，备用。培养基平时保存必须于2-8℃冰箱中。

（5）麦康凯琼脂培养基的制备

取50.03g麦康凯琼脂培养基，加热溶于1000ml 纯化水中,121℃高压灭菌 15 分钟，冷却后倾入无菌平皿，备用。培养基平时保存必须于2-8℃冰箱中。

（6）甘露醇氯化钠琼脂培养基的制备

取111.0g甘露醇氯化钠琼脂培养基，加热溶于1000ml 纯化水中,121℃高压灭菌 15 分钟，冷却后倾入无菌平皿，备用。培养基平时保存必须于2-8℃冰箱中。

（7）麦康凯液体培养基的制备

取35.0g麦康凯液体培养基，加热溶于1000ml 纯化水中,121℃高压灭菌 15 分钟，分装于试管或其他的容器中，121℃高压灭菌15min，备用。

3.供试液的制备

取三个批号:(1) __________（2）___________ (3) _____________ 氯化铵甘草口服溶液各10ml, 加约45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml,混匀，作为1：10的供试液。

取三个批号:(1) __________（2）___________ (3) _____________ 复方薄荷脑滴鼻液各10ml, 加约45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml,混匀，作为1：10的供试液。

取三个批号:(1) __________（2）___________ (3) _____________ 硼酸醇滴耳液各10ml, 加约45℃的胰酪大豆胨液体培养基至100ml,混匀，作为1：10的供试液。

4.菌液的制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中培养18-24小时，分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液，依次稀释至10-6或10-7，制成每ml含菌数为100-150 cfu的菌悬液。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养24-48小时；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液，依次稀释至10-6或10-7，制成每ml含菌数为100-150cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5-7天，加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）1ml至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液，依次稀释至10-6或10-7，制成每1ml含孢子数100-150cfu的孢子悬液。上述菌液均仅限当日使用。

5.计数方法的检查

5.1细菌、霉菌及酵母菌计数（平皿法）

5.1.1试验组（取三个批号同时操作）

取1:10的供试液和大肠埃希菌菌悬液各1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15-20ml,混匀，凝固，于30-35℃倒置培养，以48小时点计菌落数，平行制备2个平皿。

取1:10的供试液和金黄色葡萄球菌菌悬液各1ml,注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15-20ml,混匀，凝固，于30-35℃倒置培养，以48小时点计菌落数，平行制备2个平皿。

取1:10的供试液和枯草芽孢杆菌菌悬液各1ml,注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15-20ml,混匀，凝固，于30-35℃倒置培养，以48小时点计菌落数，平行制备2个平皿。

取1:10的供试液和白色念珠菌悬液各1ml,注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15-20ml,混匀，凝固，于23-28℃倒置培养，以72小时点计菌落数，平行制备2个平皿。

取1:10的供试液和黑曲霉菌悬液各1ml,注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15-20ml,混匀，凝固，于23-28℃倒置培养，以72小时点计菌落数，平行制备2个平皿。

5.1.2菌液组

取大肠埃希菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液各1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约15-20ml，混匀，凝固，于30-35℃倒置培养，以48小时点计菌落数，各平行制备2个平皿。

取白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15-20ml,混匀，凝固，于23-28℃倒置培养，以72小时点计菌落数，平行制备2个平皿。

5.1.3 供试品对照组

取1：10的供试液1 ml,注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15-20ml,混匀，凝固，于30-35℃倒置培养，以48小时点计菌落数。

取1：10的供试液1ml，注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基约15-20ml,混匀，凝固，于23-28℃倒置培养，以72小时点计菌落数，各平行制备2个平皿。

5.1.4结果判断

计算公式：回收率=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数*100%

6.控制菌大肠埃希菌的检查（仅氯化铵甘草口服溶液需要检查，且只需任选一个批号检查即可）

6.1试验液的制备

6.1.1供试品对照组

取供试液10ml（相当于供试品1g）,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的麦康凯液体培养基，于35-37℃培养24小时。

6.1.2试验组

取1：10的供试液10ml, 大肠埃希菌菌悬液1ml,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的麦康凯液体培养基，于35-37℃培养24小时。

6.1.3 阴性菌对照组

取1：10的供试液10ml,金黄色葡萄球菌菌悬液1ml,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的麦康凯液体培养基，于35-37℃培养24小时。

6.1.4阳性对照试验

取大肠埃希菌菌悬液1ml,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的麦康凯液体培养基，于35-37℃培养24小时。

6.1.5阴性对照试验

取10m胰酪大豆胨液体培养1ml,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的麦康凯液体培养基，于35-37℃培养24小时。

6.2检查

取上述各组培养物，接种于麦康凯琼脂培养基上，于35-37℃培养48小时，观察各组有无菌落生长以及生长菌落的形态。

7.控制菌铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的检查（复方薄荷脑滴鼻液和硼酸醇滴耳液需要检查，且只需任选一个批号检查即可）

7.1试验液的制备

7.1.1供试品对照组

取供试液10ml（相当于供试品1g）,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于35-37℃培养24小时。

7.1.2试验组

取1：10的供试液10ml, 铜绿假单胞菌（金黄色葡萄球菌）菌悬液1ml,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于35-37℃培养24小时。

7.1.3 阴性菌对照组

取1：10的供试液10ml,大肠埃希菌菌悬液1ml,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于35-37℃培养24小时。

7.1.4阳性对照试验

取铜绿假单胞菌（金黄色葡萄球菌）菌悬液1ml,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于35-37℃培养24小时。

7.1.5阴性对照试验

取10m胰酪大豆胨液体培养基1ml,置250ml锥形瓶中，加入约100ml的胰酪大豆胨液体培养基，于35-37℃培养24小时。

6.2检查

取上述各组培养物，接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基（溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基）上，于35-37℃培养48小时，观察各组有无菌落生长以及生长菌落的形态。

4. 工作计划

2022年1-2月 查阅参考文献， 完成实验方案细节的制定和实验菌株的传代培养等准备工作。

2022年3月 完成细菌、真菌和酵母菌总数计数的实验。

2022年4月 完成控制菌检查方法的验证实验。

5. 难点与创新点

课题特色

本课题的特色在于：

1.从医院药学的实际工作出发，以自制制剂微生物检查方法升标为背景，结合实际工作开展实用性研究，提倡学以致用。

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