商陆毒性部位对结肠水通道蛋白表达的影响开题报告

1. 研究目的与意义

商陆是商陆科植物商陆Phytolacca acinosa Roxb.或垂序商陆Phytolacca americanaL.的干燥根。商陆生品毒副作用较大，被历代本草记载为有毒。商陆临床使用不当最常见的毒副作用是腹痛腹泻。因此，本课题从结肠细胞入手，探讨商陆毒性部位对于肠道的毒性机理。

查阅大量文献得知，商陆皂苷类成分是商陆中的主要化学成分。根据研究发现商陆皂苷类成分能够刺激巨噬细胞释放炎症因子，虽然在以往的一些文献中指出商陆中的主要毒性成分是商陆皂苷甲和组织胺，甚至有些文献中直接把商陆皂苷甲称为商陆毒素。然而经最新研究表明商陆皂苷甲在一定的剂量范围内具有抗炎作用，所以，商陆毒素不应该等同于商陆皂苷甲，商陆皂苷甲并不是引起商陆毒性的主要成分。前人实验证明在石油醚、二氯甲烷、正丁醇依次萃取后商陆毒性最强部位在于正丁醇部位，本课题针对商陆正丁醇部位经乙醚沉淀后所得毒性富集部位进行其对于结肠水蛋白通道影响的定性。

本课题主要是将商陆的毒性富集部位作用于小鼠巨噬细胞和HT-29体外共培养模型中，研究商陆毒性部位刺激巨噬细胞后炎症因子的释放对肠道水转运功能蛋白的影响。

2. 文献综述

商陆炮制减毒机制研究

张 涛

（南京中医药大学，江苏 南京 210023）

[摘 要]查阅国内外相关文献，阐述商陆研究最新进展，集中阐述商陆毒性、炮制减毒和药效，其中重点阐述商陆的主要成分商陆皂苷，并且确定商陆皂苷中的主要毒性部位不在于通常所知的商陆皂苷甲，而在于商陆皂苷乙和丙。并为今后的相关研究提供一定的理论基础。

[关键词]商陆;商陆皂苷;炮制;减毒

前言中药商陆是商陆科植物商陆Phytolacca acinosaRoxb.或垂序商陆Phytolacca americana L.的干燥根^[1]。商陆味苦、寒，有毒，归肺、脾、肾、大肠经。有逐水消肿，通利二便的功能。主治水肿胀满、二便不通。用于水肿尿少，腹水胀满，外治外伤出血、痈肿疮毒等^[2]。

1.商陆的化学成分研究^[3-5]

商陆中主要含有水溶性成分：三萜皂苷、商陆多糖。脂溶性成分：棕桐酸十四脂、油酸乙醋等。蛋白多肽类成分：商陆素、商陆抗病毒蛋白等；另外还有铁、铜、锌、硒等10种人体必需微量元素、及微量的组织胺、γ氨基丁酸等其他成分。其中商陆的主要有效部位为商陆皂苷。

1.1商陆皂苷

至今为止，中外学者已从商陆的根中分离出了20个皂苷，并且得出商陆皂苷的主要成分为商陆皂苷甲。

1.1.2商陆总皂苷结构和组成^[6]

从商陆中分离得到的皂苷

glc:β-D-glucopyranosyl.Rha:α-L-rhamnopyranosyl.Xyl:β-D-xylopyranosyl.Es:esculentoside

1.1.2商陆总皂苷成分含量研究进展

邢浩等^[7]利用HPLC的方法测定商陆植物中商陆皂苷甲的含量为0.5%；范大钧等^[8]用双波长薄层扫描法测定商陆及其制剂中商陆皂苷甲的含量，认为商陆皂苷甲占商陆总皂苷的60%；马林军^[9]用萃取一比色法测定商陆胶囊中商陆总皂苷的含量，并按商陆皂苷甲的含量计算总皂苷的含量，作为药材和制剂的质量控制指标；李润平等^[10]采用硫酸香草醛比色法测定不同采收期垂序商陆有效成分含量，确认了商陆的最佳采收时期；王祝举^[11]等薄层扫描法测定商陆饮片中商陆皂苷甲含量，结果与商陆炮制后毒性降低的传统经验相吻合；张剑春等^[12]采用比色法测定并比较了国产4种商陆属植物根中主要有效成分商陆总皂苷和商陆多糖的含量，认为商陆与垂序商陆总皂普的含量都在2%左右；多糖以商陆P..acinosa 最高，达10.57%；查文清等^[13]采用薄层扫描法测定直序商陆不同炮制饮片中商陆皂苷甲的含量。结果：清蒸品、醋煮品及醋炙品中商陆皂苷甲的含量仅分别为原药材的16.73%，21.88%及45.85%。

1. 2商陆多糖

徐从立等^[14]采用HPGFC-ELSD法测定商陆多糖的重均相对分子质量；王莉等^[15]采用酚一硫酸比色法测定多糖的含量，测得商陆中多糖含量16.281%，认为商陆陆多糖含量较高，可进一步开发利用。

1. 3组胺的分析研究

王淡等^[16]TLC法测定商陆属药用植物中组胺含量在0.1%左右；程明等^[17]采用美国药典比色法测定商陆饮片中组织胺的含量，并在实验过程中推测商陆的毒性可能与组胺有关系。

1. 4微量元素的分析研究

郑汉臣^[18]测定了5种商陆属植物根中微量元素和氯基酸的含量，为合理使用该类生药提供了依据；杜莹等^[19]采用湿法消化处理样品，在优化条件下用电感偶合等离子体质谱法同时测定了25种元素波浪式分布。

2.商陆毒性研究

商陆属于中医传统的峻下逐水药，商陆药性峻猛，有大毒，可对胃肠道黏膜产生强烈的刺激，表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻，严重者可导致呕血、便血，故临床上需炮制后应用^[20]。

2.1商陆毒性在相关系统中的表现^[21-23]

消化系统损害：早期表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻，严重者可导致呕血、便血。

心血管系统损害：血压增高或下降,心动过速、心律失常。严重时也动过缓，最后可因呼吸衰竭而死亡。

神经系统损害：对神经中枢具有刺激性作用，主要表现为早期有体温升高，心动放缓，继则眩晕、头痛、胡言乱语，严重者表现为突然精神障碍，产生幻觉，甚至抽撞、昏迷。

呼吸系统损害：引起呼吸频率和节律的改变，严重者导致呼吸道的阻塞。

2.2商陆的毒性成分研究

商陆的毒性成分在一定时间内被误认为是商陆皂苷甲和组织胺，然而经过实验表明，商陆皂苷甲并不是商陆主要的毒性成分。

2.2.1商陆皂苷甲（EsA）^[24]

商陆皂苷甲（Esculentoside A，EsA）是商陆中含量最高的一种属齐墩果烷型五环三萜皂苷。动物体内抗炎试验表明，EsA对多种急、慢性炎症的动物模型均有显著的抗炎作用，且作用持久。

细胞水平实验发现，EsA在体外能显著抑制巨噬细胞释放白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、前列腺素2（PGE₂）、血小板（PAF）、NO，抑制Ca² 内流，以及抑制IL1βmRNA，IL-6mRNA和TNFmRNA的表达。

因此，商陆皂苷甲并不是商陆的主要毒性部位，并且商陆皂苷甲具有一定的抗炎作用。

2.2.2商陆皂苷乙和商陆皂苷丙（EsB、EsC）^[25]

通过实验研究结果表明，EsC能够显著降低HT-29细胞内AQP3mRNA和蛋白的表达，且EsC的毒性强于EsB，表明EsC及EsB是商陆的主要毒性成分。

2.2.3商陆皂苷与毒性作用^[25]

实验研究结果表明，将EsA、EsB、EsC、EsD、EsF这5种皂苷组合的混合物及毒性部位作用于HT-29，发现在一定剂量下5种皂苷混合物和毒性部位均能显著降低细胞内AQP3的表达，且效果强于EsB和EsC，说明商陆皂苷之间可能存在协同作用，导致各商陆皂苷混合物毒性强于单一商陆皂苷化合物。

2.3现代毒理研究

2.3.1商陆的炎症毒性研究

生品商陆能够导致兔眼结膜强烈的炎症反应，小鼠体温上升、体重下降等并使小鼠胃黏膜有显著刺激性，导致胃黏膜上皮细胞坏死、脱落^[26]。对肠黏膜淋巴细胞弥漫性浸润，杯状细胞明显减少。并伴有出血症状,这可能与商陆中商陆皂苷甲溶血性有关^[27]。这些和临床上商陆导致呕吐、腹泻，严重的导致胃肠道糜栓、出血相吻合。

2.3.2商陆的肾毒性研究

国外研究表明商陆叶子和果实水提物中含有大量皂苷类化合物，对小鼠灌胃14天后发现商陆植物水提物对肝肾有明显的损伤。对大鼠给予高、低剂量的商陆水煎液(生药40,20g/kg/d)，连续灌胃35天。发现给药之后有局部性肾小管上皮细胞变性坏死脱落，肾皮质间质纤维化^[28]。电镜下肾小管细胞部分区域微绒毛脱落，肾小管上皮细胞胞浆内有脂滴^[29]。采用基因组学的方法研究商陆肾毒性及其作用机制。发现商陆肾毒性可能是通过激活MAP、JNK和的p38三条信号通路，直接或间接引起炎症反应、细胞调亡等机制^[30]。采用代谢组学的方法探索商陆肾毒性机制，认为该机制可能与大鼠能量代谢紊乱、细胞调亡及氧化应激等有关^[31]。也有学者采用MTT法检测商陆对肾脏的毒性^[32]。

2.3.3商陆的遗传毒性研究

王一飞^[33]等人从商陆中提取总皂苷，观察商陆总皂苷对兔精子和人精子活性的影响，发现商陆总皂苷具有较强的抑制精子的活力。大剂量的商陆总皂苷能够影响小鼠嗜多染红细胞微核频率，说明商陆具有潜在的遗传毒性，孕妇和育龄妇女应该慎用^[34]。

3. 炮制研究

3.1商陆炮制历史沿革^[35]

商陆炮制历史沿革

3.2现代炮制工艺研究

2015版药典规定醋商陆为取商陆饮片，照醋炙法炒干，每100g商陆用醋30g ^[36]。

3.2.1 醋炙法

商陆醋炙以后商陆皂苷甲的含量上升，利尿功效增加，泻下作用缓和。对胃肠道的刺激性下降^[37]。

3.2.2 醋煮法

金传山^[38]等考察不同醋量对商陆毒性和药效的影响，经过LD₅₀毒性试验和祛痰实验研究醋煮商陆最佳工艺为：取商陆饮片，加30%的醋，放入锅内用文火煮至醋被吸干取出，30%的醋煮降低毒性和祛痰效果最好。

3.2.3 蒸法

研究发现清蒸法和加辅料黑豆、绿豆蒸制时间1h后商陆皂苷的含量开始下降，蒸制10h后达到稳定。商陆蒸制之后毒性下降，功效增强。检测商陆醋炙、醋蒸、清蒸、绿豆蒸、高压蒸这几种不同饮片中商陆皂苷甲的含量，发现商陆皂苷甲含量由小到大顺序为：醋蒸商陆清蒸商陆2h绿豆蒸商陆高压蒸商陆清蒸商陆1h生商陆醋炙商陆^[39]。

3.3研究商陆炮制减毒机制研究

原思通^[35]等通过考察不同炮制工艺对商陆饮片中主要毒性成分、LD₅₀和药效的影响后认为，商陆以醋煮为好。

孟祥龙^[40]等通过不同蒸制方法及时间对商陆皂苷甲成分的动态变化研究发现，商陆皂苷甲在蒸制1h后缓慢升高，随后持续下降，分析其原因可能是由于醋蒸的方法加入了酸性成分，还使饮片较长时间处于高温高湿的条件下，大量的酯键断裂，很容易产生脱水、构型转变等反应，因此醋蒸商陆中商陆皂苷甲的含量最低。从临床使用情况来看，无论是醋炙商陆，还是绿豆蒸商陆都可以有效地减毒增效。

3.4炮制工艺对商陆毒性和药效影响

吴皓、陈琳^[41]在前期对商陆的毒性减毒、炮制工艺及质量标准研究的基础上，通过对商陆醋炙前后的化学成分和药效进行对比研究，发现商陆醋炙后活性成分含量增加，泻下作用缓和，逐水作用增强，即达到了减毒增效的目的，验证了商陆传统炮制法的科学性。

通过小鼠单次大剂量给药后消化系统脏器病理切片试验发现，商陆毒性急刺激性作用主要作用于胃。除了传统的口服中毒外，商陆粉末与眼、鼻和口腔黏膜接触会出现红肿疼痛等局部刺激性反应。

通过用大鼠代谢笼试验对同一品种商陆高低剂量组、同一剂量生品商陆和醋炙商陆的利尿作用进行了对比研究，采用小鼠小肠墨汁推进试验对商陆醋炙前后的泻下作用进行对比研究。实验结果显示，商陆在一定范围内剂量越高，利尿作用越强，商陆经醋炙后泻下作用有所缓和，利尿作用有所增强。经醋炙后，对动物胃薄膜的刺激性显著减弱。商陆经醋炙后，对家兔眼结膜的刺激性显著减弱。

李一飞^[42]等通过实验表明炮制不当商陆生品苦寒有毒，长于消肿解毒。研究证实，炮制方法对商陆药效和毒性有很大影响。按LD₅₀从大到小依次为：清蒸品>醋蒸品>醋炒品>醋煮品>水煮品>生品>原药材。可见原药材和生品毒性最大。

刘忠全^[43]通过实验发现醋炙商陆的斑点明显减少，从急性毒性试验结果也可以看出，醋炙商陆的毒性是生商陆的1/3，醋炙商陆能降低毒性。

综上，醋炙法是商陆的传统炮制方法，商陆经醋炙后刺激性降低，泻下作用缓和，逐水作用增强，即达到了减毒增效的目的。

4.总结

作为传统中药，商陆以其抗炎、抗病毒、抗肿瘤及在免疫调节等方面的作用，具有极高的药用价值。因此，商陆的毒性和不良反应理应引起关注，以保证安全、合理、有效的临床应用。

虽然在一些文献中指出商陆中的主要毒性成分是商陆皂苷甲和组织胺，有些文献中直接把商陆皂苷甲称为商陆毒素。然而商陆毒素不应该等同于商陆皂苷甲，商陆皂苷甲并不是引起商陆毒性的主要成分。

张程超^[6]在前期实验中已经得出在石油醚、二氯甲烷、正丁醇依次萃取后毒性最强部位在于正丁醇部位，对商陆正丁醇部位经乙醚沉淀后上清液进行系统的分离纯化，进一步得到商陆正丁醇部位经乙醚沉淀后上清液中的皂苷类单体化合物，最后的得到β-谷甾醇、EsD、EsB、EsC、EsA和EsF六个化合物。

本文通过对于商陆化学成分、炮制工艺、毒理等多方面的研究，也能够在课题的细胞分子层面上的实验给予宏观上的帮助。

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3. 设计方案和技术路线

①70%乙醇提取商陆（已完成）

②石油醚、二氯甲烷、正丁醇依次萃取后检测商陆毒性最强部位（已完成）

③将商陆毒性最强部位正丁醇部位进行乙醚沉淀，得到乙醚上清液（已完成）

4. 工作计划

2022.02-2022.03

研究商陆醇提液毒性最强部位

2022.03-2022.04

5. 难点与创新点

本课题创新性地使用巨噬细胞和HT-29体外共培养模型，研究商陆毒性部位诱导的炎症与结肠水通道蛋白变化之间的相关性，这体外共培养模型便是本次课题的创新之所在。

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