1. 研究目的与意义
课题内容：蜈蚣具有祛风止痉、攻毒散结、通络止痛等功效，是我国传统动物药材。目前，蜈蚣的主要用药方法是水煎剂，因此对蜈蚣的水溶性成分进行研究，对进一步阐释蜈蚣的药理作用机制有重大意义。目前，对蜈蚣的核苷类成分研究甚少，本课题建立不同批次、不同产地少棘蜈蚣和多棘蜈蚣中多种核苷类成分的高效液相色谱法（HPLC）分析方法，优化蜈蚣水溶性成分的提取工艺及色谱条件，对不同批次、不同产地蜈蚣中核苷类成分进行含量检测以及差异分析，摸索蜈蚣内在质量控制方法。
课题意义：在我国，蜈蚣资源丰富、人工养殖技术成熟，为其研究和生产提供丰富的药源。同时，蜈蚣自古以来可入药，是临床上常用的动物类中药之一，并且拥有大量配伍方剂资源，为现代实验挖掘天然有效成分奠定坚实基础。中药因其标本兼治的特点在亚健康及疑难杂症方面具有独特优势。目前，药理研究表明蜈蚣具有抗凝血、抗惊厥、抑菌、抗癌及镇痛消炎等作用。但是，迄今为止，蜈蚣中许多活性成分尚不清楚，其活性成分与作用机制之间关系尚不明确。因此，蜈蚣具有研究价值。本课题利用现代手段，对蜈蚣化学成分之一核苷类成分进行定量检测，实现多组分快速测定，该方法迅速、简便，为蜈蚣化学内在质量控制提供一个可靠方法，有利于蜈蚣的开发利用。
2. 文献综述
蜈蚣的研究进展
摘要： 本文通过查阅国内外有关蜈蚣的相关文献资料，对蜈蚣的化学成分、药理作用以及临床应用三个方面进行了归纳总结，为后期的实验研究奠定文献资料基础。
3. 设计方案和技术路线
研究方案： 1实验仪器与材料 1.1实验材料 少棘蜈蚣，多棘蜈蚣（不同产地、不同批次） 1.2实验试剂 黄嘌呤，胞嘧啶，腺嘌呤，二水合黄嘌呤核苷，肌苷，胞苷，腺苷，胸苷，尿苷，鸟苷，α-脱氧腺苷，胸腺嘧啶，次黄嘌呤，2-脱氧尿苷，2'-脱氧肌苷，2'-脱氧鸟苷，2'-脱氧胞苷（均购自于Sigma公司，纯度均大于99%）；超纯水(经Milli-Q净化系统过滤)，甲醇为色谱纯（XX公司），其余试剂均为分析纯 1.3 实验仪器 Waters 2695-Waters 2998UV/Visible Detector高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)；电子分析天平（十万分之一） 2 溶液配制 2.1 供试品溶液的制备 取少棘蜈蚣、多棘蜈蚣数条，打粉，取粉末约0.5g，精密称定，置于25ml具塞锥形瓶中，精密加入10mL超纯水，超声提取60min，离心10 min（10000 r/min），取上清液于25 ml容量瓶中，残渣再同法提取2次，加超纯水至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，置与冰箱内备用。 2.2对照品储备液的制备： 分别称取17种核苷对照品适量，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，配制成17种核苷对照品储备液，浓度分别为：腺嘌呤Xmg/mL、胞苷X mg/mL、黄嘌呤Xmg/mL、次黄嘌呤Xmg/mL、尿苷Xmg/mL、胸腺嘧啶Xmg/mL、2-脱氧尿苷Xmg/mL、鸟苷Xmg/mL、2-脱氧鸟苷Xmg/mL、肌苷Xmg/mL、2-脱氧肌苷Xmg/mL、胸苷Xmg/mL，置于冰箱内备用。 混合对照品溶液制备：分别精密吸取腺嘌呤腺嘌呤XmL、胞苷X mL、黄嘌呤XmL、次黄嘌呤XmL、尿苷XmL、胸腺嘧啶XmL、2-脱氧尿苷XmL、鸟苷XmL、2-脱氧鸟苷XmL、肌苷XmL、2-脱氧肌苷XmL、胸苷XmL于50 mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，置于冰箱内备用。 3实验内容 3.1 色谱条件 Waters XSelectHSS C18Column(250 mm4.6 mm, 5 μm)（爱尔兰Waters公司）；进样体积10μL，流动相：A相为甲醇，B相为超纯水，梯度洗脱；流速1mL/min；柱温：30℃；检测波长：254nm 3.2线性关系的考察 精密吸取上述混合对照品溶液等倍稀释，稀释后的浓度为原浓度的1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，得到7个不同浓度的混合对照品溶液。按3.1项下色谱条件分析。以各色谱峰的峰面积为纵坐标Y，其对应浓度为横坐标X，建立回归方程。 3.3 检测限和定量限 精密吸取上述混合对照品溶液稀释成不同浓度混合对照品溶液，按3.1项下色谱条件分析，以S/N=3为检测限，以S/N=10为定量限。 3.4精密度试验 精密吸取某一批次、某一产地的少棘蜈蚣的供试品溶液，按3.1项下色谱条件分析，连续进样5次，计算各化合物的色谱峰面积，各化合物的色谱峰面积RSD小于3%，说明本方法精密度良好。 3.5重复性试验 取某一批次、某一产地的少棘蜈蚣粉末适量，按2.1项下方法平行制备5份，精密吸取供试品溶液，按3.1项下色谱条件分析，计算各化合物的色谱峰面积，各化合物的色谱峰面积RSD小于3%，说明本方法重复性良好。 3.6稳定性试验 精密吸取某一批次、某一产地的少棘蜈蚣的供试品溶液，按3.1项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10h进样，计算各化合物的色谱峰面积，各化合物的色谱峰面积RSD小于3%，说明各样品均在10h内稳定。 3.7加样回收率 混合对照品溶液的配制：分别精密称定腺嘌呤Xmg、胞苷X mg、黄嘌呤Xmg、次黄嘌呤Xmg、尿苷Xmg、胸腺嘧啶Xmg、2-脱氧尿苷Xmg、鸟苷Xmg、2-脱氧鸟苷Xmg、肌苷Xmg、2-脱氧肌苷Xmg、胸苷Xmg置于100 mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，摇匀。 称取各蜈蚣粉末0.5 g，各6份,精密称定，置于25 ml具塞锥形瓶中，分别精密加入上述混合对照品溶液适量，按2.1项下方法制备供试品溶液，按3.1项下色谱条件分析，计算各化合物的色谱峰面积，各化合物的色谱峰面积RSD小于3%，说明本方法回收率良好。 3.8 含量检测 按2.1项下方法制备供试品溶液，按3.1项下色谱条件测定各批次、各产地蜈蚣的核苷类成分的含量。 技术路线： |
4. 工作计划
1月至2月：查阅关于蜈蚣的化学成分、药理作用及临床应用等中英文文献、收集相关资料
2月至3月：撰写蜈蚣研究进展的文献，设计蜈蚣核苷类成分含量测定的实验方案，撰写开题报告，收集各产地、各批次的蜈蚣
3月至4月：建立HPLC法，优化色谱条件，优化蜈蚣提取工艺，方法学考察，测定蜈蚣核苷类成分含量，结果分析
5. 难点与创新点
1.首次建立HPLC方法研究蜈蚣中核苷类成分含量
2.比较分析不同批次、不同产地蜈蚣中核苷类成分含量差异
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