响应面法优化通关藤总黄酮提取条件的研究开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

本课题的意义：

中药通关藤是目前公认的抗肿瘤效果较好的植物药。现代研究证明，通关藤能提高免疫力、延缓衰老、抗氧化和抗肿瘤等作用。对通关藤中黄酮提取方法的改进和优化是提高通关藤黄酮得率和保证黄酮生物学活性的关键。本研究以通关藤作为原料，以总黄酮得率为考察指标，通过单因素试验和响应面试验确定浸提方法的最佳工艺参数。研究结果有助于进一步开展黄酮类化合物构效关系的研究，并对科学评价和充分利用通关藤有十分重要的学术价值和社会经济意义。

国内外研究概况：

1．通关藤相关药理成分研究进展

1．1通关藤药理作用研究进展

1．1．1抗肿瘤作用

方奕奇等报道药理实验表明，通关藤提取物对白血病U937、HL60细胞有明显的抑制和诱导凋亡作用，其机制为通关藤能通过降低线粒体跨膜电位触发白血病细胞凋亡，抑制白血病细胞增殖[1]。

1．1．2平喘作用

辛海丽等报道，动物实验表明通关藤苷有一定的平喘作用，其对正常状态的支气管无松弛作用，对痉挛状态的气管(组织胺造成的痉挛)有直接松弛作用，但其对镇咳祛痰无明显作用[2，3]。

1．1．3降血压作用

通关藤苷有短时轻度的降压作用，其降压机制可能与抑制丘脑下部的交感中枢无关，而是有直接的血管扩张作用，并能对抗肾上腺素或去甲肾上腺素对血管的收缩作用，且根据动物实验及临床验证无明显的毒副作用[4]。

1．1．4其他作用

通关藤尚有戒毒、止痛作用。卢永向等报道，开发了一种以通关藤为主药的中成药，可治急性疼痛、可止癌痛，吸毒者使用后7天即戒断毒瘾，且不二次成瘾，复吸率低。此外，通关藤还用于治疗喉头炎、口腔溃烂以及疮肿毒。临床上，通关藤还有保肝利尿，恢复肿瘤病人放、化疗后白细胞下降的作用。其总苷对肺炎双球菌和流感杆菌有一定作用[5]。

1．2通关藤化学成分研究进展

1．2．1提取物

马明芳等利用正、反相硅胶柱色谱从通关藤水提取物中分离得到10个化合物，结合MS，IR，UV，1HNMR，13C-NMR等现代波谱学技术和理化常数测定确定了其结构分别为美国商陆脑苷(poke-weedcerebroside，I)、牛奶菜醇A(Ⅳ)、半乳糖醇(Ⅵ)、胡萝卜苷(Ⅸ)、丁二酸(X)等。其中化合物I，V是首次从该属植物中分离得到；化合物Ⅱ，Ⅵ～Ⅷ，X为首次从该植物中分离得到[6，7]。

其结构分别为美国商陆脑苷(poke-weedcerebroside，I)、牛奶菜醇A(Ⅳ)、半乳糖醇(Ⅵ)、胡萝卜苷(Ⅸ)、丁二酸(X)等。其中化合物I，V是首次从该属植物中分离得到；化合物Ⅱ，Ⅵ～Ⅷ，X为首次从该植物中分离得到[6，7]。

1．2．2甾体C21

甾体苷类化合物是近年来研究最多的通关藤中活性化学成分，近10年新发现的C21甾体化合物已有30余种，其特点是苷元11和12位常与常见的有机酸苯甲酸、顺芷酸、桂皮酸等形成酯，苷元3位与多β-去氧糖相连。苷元主要有6种不同的结构(Ⅰ～Ⅵ)。

1．2．3醇类

石慧还从通关藤的正丁醇层提取物得到胡萝卜苷、豆甾醇、β-谷甾醇3个甾醇类化合物和1个环醇类化合物牛奶菜醇，用95%工业酒精首次从通关藤提取物的石油醚层浸膏中分离并鉴定出豆甾醇(stigmasterol，ws-4)，β-谷甾醇，蒲公英甾醇[8]。

1．2．4萜类化合物

张慧等利用SephadexLH-20凝胶柱色谱法、硅胶柱色谱法以及半制备高效液相色谱法，首次在从通关藤的正丁醇萃取物中分离得到，确定了羽扇豆醇(1upeo1)、白桦酯醇(betulin)、白桦酯酸(betulinicacid和B-香树脂醇(B-amyrin)4种五环三萜类化合物[9]。

1．2．5多糖

聂丽华等对通关藤药材经醇提后进行水提醇沉法提取多糖，用苯酚-硫酸法测定多糖的质量分数为74．4%。李斌用紫外光谱扫描和红外光谱对骨藤多糖进行精制分离得到通关藤多糖，经初步结构认证，得到CMP-I，CMP-Ⅱ，CMP-Ⅲ3个单体。

2．中药黄酮的研究进展

2．1黄酮的研究概况

黄酮类化合物指的一系列化合物的总称，是植物的次级代谢产物，其最主要的结构是包含两个带酚羟基的苯环，同时还含有甲基、甲氧基、酚羟基、异戊烯基等官能团。学者们根据官能团与母环性质的不同，将黄酮类化合物分为黄酮类、黄酮醇、二氢黄酮、花青素类和查耳酮等十五种化合物。黄酮生理作用丰富：抗氧化抗衰老、抗癌、抗肿瘤、抗菌和病毒并且改善心血管系统作用等。近年来，由于黄酮药用价值不断得到开发，其黄酮的提取技术优化和应用渐渐提上了日程。

2．2黄酮提取分离方法

2．2．1热水浸提法

热水浸提法是浸提中药的传统方法，其优点为：成本低、无有机溶剂和环境污染、可将水提液直接作为原料用于生产。但该方法浸提的黄酮得率比较低，含无机盐、糖

类等多种杂质。现在一般是用微波、超声波等方法将原料处理后进行水提。刘祥义将超声波处理后的元宝枫叶用水浸提，不仅提高了浸出总黄酮的含量，也简化了操作方法[10]。

2．2．2碱水提取法

碱性稀醇或碱性水可让黄酮结合酸性的酚羟基生成盐而易溶于水，浸提液经酸化就可得到黄酮类化合物。碱性溶液主要是加入稀氢氧化钠、石灰水或碳酸钠等。

2．2．3醇提法

因乙醇无毒且价格低廉的特性，使其成为提取工艺中常用的有机溶剂，据处理方式的不同分为回流、渗流、浸渍等。其中醇回流法是最常用的提取方法，主要是浸提操作简单，效率较高。渗辘法是利用溶液浓度差来浸提，该方法所得的浸提液杂质含量少，但所需的浸提时间长，溶剂用量较大。

2．2．4超声波辅助浸提法

超声波主要运用的是超声空化产生的极大压力，使破碎细胞壁，引起引起一系列反应，从而整体上提高浸提过程中的传质的速率和效果，有效地提高了浸提液中黄酮的含量，起到了辅助的效果。超声波辅助浸提法提具有操作简便、时间短、效率高、节能等特点[11，12]

2．2．5酶法提取

酶法浸取是适用于原料的有效成分被细胞壁包围而不易浸提的物质。常用的酶有果胶酶和纤维素酶等。在较温和的条件下利用酶反应将细胞壁分解，从而加速释放有效成分，还可将杂质如果胶、蛋白质等分解去除，其优点是专属性强、无有机溶剂、效率高[13]。

3．通关藤黄酮提取工艺

3．1通关藤黄酮的提取

通关藤的提取是称取0．4g的通关藤样品与10ml离心管中，按照料液比1：20的比例即加入8ml的50%乙醇。然后超声2小时，之后离心充分。定容于10ml容量瓶中，去上清液为黄酮。

3．2优化通关藤黄酮提取工艺

孟衡玲等[14]采用乙醇回流提取法并且对其优化处理。研究设计了L9(34)正交试验提取通关藤中的黄酮类化合物，选取提取温度、料液比、乙醇体积分数、提取时间作为考察的4个因素，以黄酮提取量作为考察指标，为综合开发和利用通关藤中总黄酮成分提供科学依据。结果表明，提取温度、料液比、乙醇体积分数、提取时间对通关藤中总黄酮的提取率均有影响，影响顺序为乙醇体积分数＞料液比＞提取时间＞提取温度。

4．响应面法

响应面法(ResponseSurfaceMethodology，简称RSM)结合了统计方法和数学方法，能够用来分析所感兴趣的多个变量与其响应的结果之间的关心，并进行建模和分析，达到优化响应值的最终目的。它能解决很多工程中遇到的约束函数和目标达到优化响应值的最终目的。它能解决很多工程中遇到的约束函数和目标函数对于设计因素之间的光滑线性的问题，避免了直线线性关系，这样便能将确定性仿真和随机性仿真的问题结合在一起，并且提供了可靠性分析和结构优化设计。常用的组合方式有：对于多因素的有CCD、BBD、对小规模试验还可以采用Hybrid设计和Koshal设计，此外，还可以采用D2优化准则、G2优化准则系列、A2优化准则的设计方法．至今响应面法在医学、生物制药领域、生物学、食品工业以及化学工业等各个领域得到了，故而得到了广泛的应用。从本质上来讲，响应面法是具有一个体系的统计方法，其基础思想是构造一个明确的多元方程来表达隐式功能函数，从而实现在输入变异和不确定的变量后能够得出最佳的响应值。

应用前景

以通关藤为主要原料药材制成的注射剂和片剂，作为治疗肺癌、食道癌、胃癌、直肠癌等恶性肿瘤的药物在临床广泛应用。通过对通关藤化学成分、药理药效等方面的研究发现黄酮类成分在其临床疗效成中起着重要作用。为了深入开发利用通关藤黄酮类成分，采用响应面法优化通关藤黄酮的提取工艺，以最经济的方式，较少的实验次数和较短的时间进行全面研究，开拓较为广阔的应用前景。

参考文献：

[1]方奕奇，孙雪梅．通关藤化学成分及抗肿瘤作用的研究进展．中国生化药物杂志．2011，32(2)：165-167．

[2]邓士贤，莫云强．通光藤甙的药理研究．昆明医学院学报，1982(03)：1-4．

[3]石慧，崔炯谟，赵余庆．通光藤化学成分及生物活性研究．中国现代中药，2007(7)：28-30．

[4]方奕奇与孙雪梅，消癌平注射液体外作用于HEL细胞株的实验研究．医学信息(中旬刊)，2010(6)：第1538页．

[5]石慧，通光藤抗肿瘤化学成分的研究．2007，延边大学．

[6]蔡健，黄酮提取工艺研究进展．淮阴工学院学报，2003．12(5)：82-85．

[7]王军，基于响应曲面法的苦荞麸皮总黄酮提取工艺优化．农业机械学报，2007．38(7)：205-208．

[8]石慧，通光藤的化学成分研究．中草药，2008．39(7)：970-972．

[9]张慧，通关藤及其混淆品的RAPD鉴别研究．中药材，2011．34(9)：1355-1357．

[10]李荣等，正交设计研究金银花总黄酮提取工艺．ActaUniversitatisMedicinalisAnhui，2006(4)：第410-412页．

[11]张喜梅，葛根总黄酮提取工艺研究．现代食品科技，2008．24(1)：42-45．

[12]王振宇，夏祥慧，李宏菊．响应面分析法优化大果沙棘总黄酮提取工艺．东北林业大学学报，2009．37(6)：30-32．

[13]王昌禄等，香椿老叶总黄酮提取工艺及其抗氧化活性的研究．北京林业大学学报，2008．30(4)：第28-33页．

[14]孟衡玲，杨生超，苏一兰．药用植物通关藤中总黄酮提取工艺研究[J]．河南农业科学，2013，42(9)：157-160．

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法

1文献研究法

2实验法

3因素分析法

4响应面分析法

5数量研究法

技术路线

精选材料打粉烘干→→优化提取条件→

实验方案及可行性分析

1.黄酮的测定

于10ml容量瓶中，加入黄酮样品液0．8ml再加入0．4ml的5%亚硝酸钠，摇匀静止6min后加入0．4ml的10%硝酸钠溶液，摇匀静止6min后加入4ml的1mol/l的氢氧化钠，最后加60%乙醇定容，静止15min，以芦丁标准液为对照在510nm处测定吸收值。

2．单因素实验

2．1液料比对黄酮提取率的影响

分别称取1g通关藤粉末，置于9个100mL锥形瓶中，在室温下，按液料体积质量比1：6、1：8、1：10、1：12、1：15、1：18、1：20、1：25、1：30加入60%乙醇，超声时间30min，充分离心，取上清测定黄酮的含量。

2．2醇浓度对黄酮提取率的影响

分别称取1g通关藤粉末，置于9个100mL锥形瓶中，在室温下，按料液比1：15加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇，超声时间30min，充分离心，取上清测定黄酮的含量。

2．3超声时间对黄酮提取率的影响

分别称取1g通关藤粉末，置于6个100mL锥形瓶中，在室温下，按液料体积质量比1：15加入60%乙醇，分别超声时间20min、40min、60min、80min、100min、120min，充分离心，取上清测定黄酮的含量。

2．4温度对黄酮提取率的影响

分别称取1g通关藤粉末，置于6个100mL锥形瓶中，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下，按液料体积质量比1：15加入60%乙醇，浸泡1小时，充分离心，取上清测定黄酮的含量。

可行性：

关于黄酮提取相关文献以及研究已经较为丰富，有着扎实的研究基础；借由学院网站查询以及专业人士指导，有着先进的研究平台；师资力量也是较为雄厚，有硕博士的监督以及老师教授的指导，这些都大大提高了本实验的可行性。