1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题研究意义、国内外研究概况和应用前景 研究意义 花粉是高等植物的雄配子体，负责在有性繁殖中传递雄性亲本的遗传信息。广义上的花粉生活力是指花粉具有的存活、生长、萌发和发育的能力[1]。在药用植物常规育种过程中，为了进行杂交授粉、辅助授粉和解决远距离杂交、亲本花期不一致的问题，需要早期采集和贮存花粉，而如何进行花粉生活力检测和有效保存花粉生活力是关键点所在[2]。对这两者的探究可以为药用植物藿香的品种选育和种子生产提供理论基础和实践依据。 国内外研究概况 测定花粉生活力的方法主要有染色法、离体萌发测定法、花粉授粉结实检测法[3]。其中，染色法是根据胞质的有无，酶活情况进行染色测定，包括联苯胺染色法（过氧化物酶染色法），氯化三苯基四氮唑染色法(TTC法)，I-KI染色法，荧光染料反应法（FCR法），醋酸杨红染色法[4]和红墨水染色法[5]等方法。但是不同植物的花粉因其自身结构特性和花粉内含物的差异，适宜测定不同类群植物花粉生活力的染色方法也就有所不同。例如，0.5%TTC溶液未能使老鸦瓣花粉染色，而10%红墨水能则将部分花粉染成红色[5]。TTC染色法适用于辣椒花粉生活力的测定，I-KI染色法和醋酸杨红染色法因出现与实际相反的结果不能被使用[6]。蓝墨水染色法测定值可以用于梨花粉生活力的快速测定，因I-KI 染色法的测定值均为极显著偏低，MTT染色法测定值显著偏高，所以后两者都不适用于梨花粉生活力测定[7]。离体萌发法是抽取花粉在培养基上萌发，在显微镜下观察花粉的萌发率，以此作为花粉生活力的标准。一般把花粉管的长度大于、等于花粉的直径作为花粉萌发的标准[2]。花粉离体萌发测定法简单、迅速、合理，但培养条件有差异时，测定结果可能有差异。将新鲜花粉与经过贮藏后的花粉给相关植物授粉，观测并比较花粉贮藏前后授粉之后的结实率。此方法根据结实情况判断花粉生活力，比较可靠和精确，但费时费力，只能定性而不能定量[3]。 花粉的寿命很短，但在特殊的条件下保存，可在较长时间内保持其生活力，延长花粉寿命，而温度则是影响花粉生活力变化的主要因素之一[3]。一般情况下，温度与花粉贮藏寿命呈负相关性，且随着时间的延长，花粉活力会逐渐降低。实践证明，在超低温度(-180℃ ～ -270℃)下，花粉的生活力可以长期保存。如龙眼花粉在4℃条件下保存一年后丧失萌发能力，但在-20℃条件下保存一年后萌发率仍然能保持在70%左右[8]。桃花花粉在-10℃、0℃、10℃、20℃四个温度条件下保存27天，花粉生活力在0℃时下降最为缓慢，20℃时下降得最为迅速[9]。还有研究表明-20℃仍能使转基因烟草花粉保持较高生活力，并且将该温度下保存的花粉进行授粉长出的植株还能表达出抗乳腺癌单克隆抗体mAb BR55。实际过程中，储藏温度会影响植物花粉的生理生化反应。吴巨友等研究发现，4℃时，梨花粉细胞内Ca2 浓度升高，胞内K 外流，同时激动蛋白细胞骨架发生聚合现象[10]。戚行江等认为，4℃和-20℃的温度下储存的杨梅花粉保护酶（SOD酶、POD酶、CAT酶）基本都有阶段性的升高，短时间增强了清除活性氧的能力，能维持杨梅花粉较强的生活力[11]。唐菖蒲花粉-80℃保存时可溶性蛋白和可溶性糖含量的提高，在一定程度上维持了花粉的活性[12]。但也有些禾本科植物却不耐低温，例如玉米花粉在低于-17℃以下就不易贮藏[13]。 藿香Agastache rugosa (Fisch. et Mey.) O. Ktz，别名土藿香、野藿香、苏藿香、排香草等，为唇形科藿香属植物。医药书籍所载药材霍香包括唇形科植物刺蕊草属植物 |
广蕾香Pogostemarc ablin (Blanco) Benth和藿香两种植物[14]。但两者在植物形态和化成分上都有所差异。2015版《中国药典》并没有收录藿香，但在我国西南部分地区以及东亚其他国家作为民间习惯用药还在应用。藿香性辛，有祛暑解表、芳香化湿和胃之功效，主治夏令感冒，寒热头痛，呕吐泄湾，妊娠呕吐等[15]。现代药理实验表明藿香对小鼠胃肠动力障碍具有调节作用[16]，其精油能抗动脉粥样化[17]和抑制毛藓菌生长[18]，藿香多糖具有抗氧化作用[19]等功能。除作药用外，藿香还用于食用调味、香料及化妆品、观赏、驱虫等方面[20]，因此藿香是开发前景广阔，具有较高经济价值的植物。 作为具有芳香性的药用植物，目前国内外对藿香的研究多集中于藿香挥发油提取和成分分析[21]，药用活性成分分析、药理作用[22] [23] [24] 、栽培技术[25]等方面。在药用植物领域，已有对蔓荆、玫瑰、丁香等花粉的相关研究，关于藿香花粉生活力和贮藏的研究尚未见报道。 应用前景 花粉活力测定是研究花粉贮藏期间控制花粉生活力、花粉与柱头间的相互识别、品种改良和育种工作、基因库的保持、不亲和性与受精关系、外部条件对花粉萌发的影响以及基因流等的基础。藿香广泛分布于我国南北各地，如四川、江苏、浙江和湖南等省，以及朝鲜、日本和西伯利亚地区，野生和栽培类型都有。藿香资源丰富，可以进行杂交育种工作，获得优质稳产类型，在这过程中难免会出现远距离杂交和花期不遇问题，确定藿香花粉生活力测定方法和探究温度对花粉生活力的影响对解决上述问题具有指导意义，同时也为更深层次的研究奠定基础。 参考文献： [1] 陈 晶，张月学，唐凤兰等. 紫花苜蓿花粉生活力测定方法研究[J].草地学报，2010，18（2）：297. [2] 左丹丹，明军，刘春，王丽娜. 植物花粉生活力检测技术进展[J].安徽农业科学，2007，35(16)：4742. [3] 刘 芳，周蕴薇. 花粉的保存及生活力测定方法的探讨[J].南方农业，2007，1（3）：70. [4] 刘程宏，宋尚伟，张芳明. 果树花粉生活力检测研究进展[J].河南农业学报，2011，40(10)：13-16. [5] 吴正军，朱再标，郭巧生等. 老鸦瓣传粉生物学初步研究[J].中国中药杂志，2012，37（3）：293. [6] 张子学，孙峰. 辣椒花粉生活力最佳测定方法的筛选[J].种子，1:32-33. [7] 姜雪婷，杜玉虎，张绍铃等. 梨43个品种花粉生活力及4种测定方法的比较[J].果树学报，2006, 23(2): 178～181. [8] Phama V T, Herrerob M, Hormaza J I. Effect of temperature on pollen germination and pollen tube growthin longan (Dimocarpus longan Lour)[J]. Scientia Horticulturae, 2015, 197: 470-475. [9] 马杰. 不同贮藏温度和时间对桃花粉生活力的影响[J].吉林农业科学2013，38（5）：73-76. [10] Wu J Y, Jin C, Qu H Y. Low temperature inhibits pollen viability by alteration of actin cytoskeleton and regulation of pollen plasma membrane ion channels in Pyrus pyrifolia[J]. Environmental and Experimental Botany, 2012, 78: 7075. [11] 戚行江，任海英，梁森苗等. 贮藏温度和时间对杨梅和蜡杨梅花粉萌发率及保护酶活性的影响[J]. 果树学报，2014，31（3）：467. [12] 黄蓓丽.唐菖蒲划分的低温保存研究[D].南京：南京林业大学，2010. [13] 王钦丽，卢龙斗，吴小琴等. 花粉的保存及其生活力测定[J]. 植物学通报，2002，19(3)：366. [14] 江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M.上海:上海科技出版社，1985：2710-2711 [15] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草.7卷[M].上海:上海科学技术出社，1999：3-5. [16] 张慧慧.藿香对小鼠胃肠功能影响的研究[D].成都：成都中医药大学，2014. [17] Hong J H, Chao J H，Oh S R, et al. Inhibition of cytokine-induced vascular cell adhesion molecule-1 expression; possible mechanism for antiatherogenic effect of Agastache rugose [J]. EBS Lett, 2001, 495:142-147. [18] Shin S. Essential Oil Compounds from Agastache rugosa as Antifungal Agents Against Trichophyton Species [J]. Arch Pharm Res, 2004, 27(3): 295-299. [19] 刘存芳.藿香枝叶多糖的提取工艺及其清除羟基自由基作用研宄[J].氨基酸和生物，2012，34(3)：1-3. [20] 严雯.新疆土藿香挥发油及芳香物质的研究[D].乌鲁木齐：新疆大学，2011. [21] Skakovskii E D, Kiselev W P, Tychinskaya L Y, et al. Characterization of the essential oil of Agastache rugosa by NMR spectroscopy [J]. Journal of Applied Spectroscopy, 2010, 77(3): 329-334. [22] K T, Kim G S, Kim Y H, et al. The polyphenolic profiles and antioxidant effects of Agastache rugosa Kuntze (Banga) flower, leaf, stem and root [J]. Biomed Chromatogr, 2016. doi:10.1002/bmc.3539. [23] Oh H M, Kang Y J, Kim S H, et al. Agastache rugosa leaf extract inhibits the iNOS expression in ROS 17/2.8 cells activated with TNF-α and IL-1β [J]. Archives of Pharmacal Research, 2005, 28 (3): 305-310. [24] Kim H, Chuang M T, Kim Y K, et al. The effect of the oil of Agastache rugosa O. Kuntze and three of its components on human cancer cell lines [J]. Journal of Essential Oil Research, 2001, 13 (3): 214-218. |
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
（1）对2种藿香花粉生活力的测定方法进行比较，为藿香花粉的后续研究奠定基础
（2）总结储藏温度对藿香花粉生活力的影响规律，为藿香花粉储存条件的确定提供理论依据。
3. 研究的方法与方案
研究方法
大棚内盆栽河北1、河北2、四川、吉林、河南5个产地的藿香，在8月份藿香开花时采集新鲜花粉作为实验材料。分别使用红墨水法和TTC法检测花粉生活力并根据染色效果对这两种方法进行比较。
采集藿香新鲜花粉，经过适当的前处理，将花粉分别置于-20℃、-7℃、4℃、20℃条件下进行储藏，每隔一段时间检测花粉生活力。根据统计数据探究不同储藏温度对不同产地藿香花粉生活力的影响。
4. 研究创新点
藿香是一种集药用、食用、油用、观赏价值为一身的多用经济植物，具有广阔的开发前景和经济价值。且藿香适应性强，能耐低温，好高温潮湿，分布地域广，易于种植。目前国内外对藿香的研究多集中于药理分析、挥发油提取和成分分析、栽培技术优化方面，关于藿香花粉的研究却没有报道。研究藿香花粉生活力的检测方法和探究储藏温度对花粉生活力的影响可以为其杂交育种工作和种子生产提供科学依据，也可以为更深层次的植物生理和基因研究工作奠定基础。
5. 研究计划与进展
2015.04-2015.07： 种植藿香，进行日常管理
2015.08：采集藿香花粉，进行储藏试验
2015.9-2016.4 整理数据得出结论，完成研究报告一份
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