1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
桔梗(Platycodon grifus (Jacq.)A.Dc.)作为桔梗科 (Campanulaceae) 植物，其根可以入药，具有祛痰止咳、宣肺、排脓作用，用于咳嗽痰多、胸闷不畅、咽喉肿痛、肺痈咳吐脓痰等症[1]。其嫩茎叶和根均可供蔬食。我国大部分省区均有分布，在东亚、前苏联远东地区、朝鲜半岛、日本列岛也有分布[2]。桔梗的主要含桔梗皂苷D、菊糖、桔梗聚糖、葡萄糖及植物甾醇等成分，具有抗炎、祛痰、镇咳、抗溃疡、降血压、扩张血管、解热镇痛镇静、降血糖、抗胆碱、促进胆酸分泌、抗过敏及增强人体免疫力等广泛的药理作用[3]。近年来，对桔梗的研究主要集中在化学成分、药理作用、有效成分的提取等方面，对栽培技术基础研究相对欠缺。
氮是植物重要的营养元素，植物体吸收的氮素形态主要有无机态氮（硝态氮和铵态氮）、有机态氮如尿素等，各种形态氮吸收利用的形式是不同的，但进入植物体后，最终都要以同样的方式经过谷氨酸或谷氨酰胺的转氮作用形成不同的氨基酸，进而合成蛋白质。氮素的吸收和同化与植物的很多生理过程（如光合作用、光呼吸等）、产量和品质关系密切[4] 。不同形态氮肥对植物的生长发育和产量的影响有较大差异，并对氮素同化过程中的关键酶有重要的影响[5]。肖云华等[6]研究表明，不同的氮素形态和浓度对菘蓝生物量和活性成分含量的影响存在很大差异，酞胺态氮对菘蓝生物量的影响最大，其次是铵态氮，影响最小的是硝态氮，生物量并不随着总氮量提高而增加，而与氮素形态有关。范巧佳等[7]研究表明，硝态氮、铵态氮、酰胺态氮均可在一定程度上促进川芎的生长，延长其根长，茎孽数增加，干物质积累增加，从而显著提高川芎的产量以及阿魏酸和生物碱含量。在硝态氮、铵态氮和酰胺态氮单独施用时，以尿素的增产增收和改善品质的效果最好，硝态氮最差。陈震[8]等研究发现，以硝态氮或增加少量铰态氮培植毛花洋地黄时，植株生长旺盛可以得到较高产量，而培植西洋参时采用铰态氮供氮，植株才可茁壮生长。段云晶[9]等研究表明不同氮素形态对桔梗植株各项生理代谢过程影响显著，适当的氮素形态配比较单一形态氮素更利于促进桔梗光合作用、氮素代谢、抗逆调节的进行及生物量、活性成分的累积。
而钼是植物必需的微量营养元素之一，对药用植物的生长影响重大。在对圆叶千金藤[10]的研究中发现，施用含钼元素的微肥能促进其发育，使其生物活性物质增加，块茎中所含药效成分轮环藤宁(Cycleanine)增高。徐继振等人[11]报道，栽培当归中施用钼，锰，锌，硼微肥均有一定的增产效果，而以施钼作用最大，可达14.69；施用含钼的微肥能提高当归中挥发油、多糖、70醇溶物和阿魏酸含量，提高药材质量。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：（1）了解氮素形态及钼对桔梗生长的影响
（2）了解氮素形态及钼对桔梗质量的影响。
研究内容（1）研究氮素形态及钼对桔梗的生长状态的影响。
3. 研究的方法与方案
1 试验材料
试验繁殖材料为桔梗一年生幼苗。栽培基质为蛭石。基本营养液配方采用Hogl营养液配方。
2 试验设计
将一年生桔梗栽入盆中，每盆10 株，共 50 盆。试验设Mo1(0.8)Mo2(0.4)和Mo三个钼水平，铵态氮、硝态氮、酰胺态氮三种氮素形态（N水平15 mmolL-1），共9个处理，每处理三个重复。处理每 10 天一次。测桔梗生长指标，生理生化指标，质量指标。
3 测定项目与方法
3.1 生长指标
桔梗生长1个月后，每个处理随机采集 5 株，洗净，测量其茎长、叶长、根长，称量植株地上部分和地下部分的鲜重，105 ℃ 杀青1 min，于60 ℃ 烘干至恒重后，称量其干重。
3.2 生理生化指标
3.2.1硝酸盐和亚硝酸盐含量的测定
3.2.1.1硝酸盐含量
吸取500 gml-1 NO3N标准溶液 1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml、10 ml、12 ml分别放入50 ml 容量瓶中，用去离子水定容至刻度，使之成为10、20、40、60、80、100、120 gml-1 NO3N的系列标准溶液。
吸取上述标准溶液0.1 ml ，分别放入刻度试管中，以0.1 ml 去离子水代替标准溶液做空白，再分别加入0.4 ml 5 水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20 min 后，再加入 8 NaOH溶液9.5 ml ，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10 ml。
以空白作对比，在410 nm下测定吸光度，制作标准曲线并计算回归方程。
取一定量的样品剪碎混匀，精确称取2~3 g 3 份，分别放入 3 支刻度试管中，加入10 ml 去离子水，用玻璃珠封口，置入沸水浴中提取 30 min ，用自来水冷却，将提取液过滤到25 ml 容量瓶中，并反复冲洗残渣，最后定容至刻度。
吸取样品液0.1 ml 分别于3支刻度试管中，然后加入5水杨酸-硫酸溶液0.4 ml，混匀后置室温下20 min ，再慢慢加入9.5 ml 8NaOH溶液，待冷却至室温后，用空白做对比，在410 nm 处测定吸光度，计算NO3N含量。
3.2.1.2亚硝酸盐含量的测定
取0.3g叶片于研钵中，加0.5ml饱和硼砂溶液，适量水研磨成匀浆，沸水浴15min，冷却后加0.2ml亚铁氰化钾，0.2ml乙酸锌，摇匀，离心管中定容至10ml，离心取上清定容至8ml,放置30min，去除表层脂肪层。
取4ml上清，加0.2ml对氨基苯磺酸，3-5min静置，加0.1ml盐酸萘乙二胺，定容至5ml，15min后538nm下测定吸光值，计算亚硝酸盐的含量。
3.3硝酸还原酶（NR）活力的测定
标准曲线的制作：取7支洁净烘干的15 ml 刻度试管按表1顺序加入试剂，配成0~2.0 g 的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25 ℃ 下保温30 min，然后在540 nm 下比色测定。以亚硝态氮为横坐标，吸光度值为纵坐标建立回归方程。
试剂/ml 1 2 3 4 5 6 7 |
亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 1磺胺 4 4 4 4 4 4 4 0.02萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4 每管含亚硝态氮/g 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 |
酶的提取：称取0.5 g 鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30 min，取出置冰浴中加少量石英砂及4 ml提取缓冲液，研磨匀浆，转入离心管中在4 ℃、4000 r/min 下离心15 min，上清液即为酶粗提取液。
酶的反应：取粗提取液0.4 ml 于10 ml 试管中，加入1.2 ml 0.1 mol/L KNO3磷酸缓冲液和0.4 ml NADH溶液，混匀，在25 ℃水浴中保温30 min，对照不加NADH溶液，而以 0.4 ml 0.1 mol/L pH 7.5 的缓冲溶液代替。
终止反应和比色测定：保温结束后立即加入1 ml 磺胺溶液终止酶反应，再加入1 ml 萘基乙烯胺溶液，显色15 min 后于4000 r/min 下离心15 min ，取上清液在540 nm
下比色测定。根据回归方程计算亚硝态氮总量。
3.4相关生理指标测定
3.4.1 SOD酶活性的测定
取0.5g叶片，加入5ml酶提取液（50mmol/L PH7.0 PBS 0.4pvp），冰浴研磨，10000r/min,离心20-30min，去上清液。取0.1ml酶液，依次加入0.05mol/L PH 7.8 PBS 1.5ml,130mmol/L MET 0.3ml,750μmol/L NBT
0.3ml,100μmol/LEDTA-Na 0.3ml,70μmol/L核黄素0.3ml。置于透明试管架光照15min。以不光照最大管为CK，在560nm下比色测定。计算SOD的活性。
3.4.2 POD活性测定
取0.5g叶片，加入5ml酶提取液（50mmol/L PH7.0 PBS 0.4pvp），冰浴研磨，10000r/min,离心20-30min，去上清液。取0.1ml酶液，加入POD混合液3ml，在470nm下测定吸光值。对照为煮沸的酶液。计算POD的活性。
3.4.3 CAT活性测定
取0.5g叶片，加入5ml酶提取液（50mmol/L PH7.0 PBS 0.4pvp），冰浴研磨，10000r/min,离心20-30min，去上清液。取0.5ml酶液，加入4ml 50mmol/L PH 7.0 PBS，在30℃下水浴10min,加入1ml 50mmol/LH2O2 反应1min,再加入2ml 10 硫酸终止反应。用10mmol/L KMnO4滴定至粉红色。计算CAT的活性。（空白对照为煮沸的酶液）
3.4.4 MDA含量测定
取0.5g叶片，加入5ml酶提取液（50mmol/L PH7.0 PBS 0.4pvp），冰浴研磨，10000r/min,离心20-30min，去上清液。取2ml酶液，加入4ml TCA-TBA混合液，沸水浴2Min，4000 r/min,离心5-10min，取上清液，分别在532nm，600nm,450nm下测定其吸光值。计算MDA的含量。
4 质量评价
维生素含量的测定
称取桔梗根新鲜根适量于研钵中加入2草酸溶液约5ml研碎，通过漏斗将研碎的样品倒入15ml具塞试管中，静置离心15min后，过滤，取滤液10ml于蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并且在30s内不褪色为终点，记下染料的用量（重复两次取平均值）。
4.1桔梗多糖的测定
精密称取桔梗根干燥粉末适量于100m1具塞三角瓶中，加80EtOH 45m1，浸泡30min，超声提取30min，充分静置，过滤于100m1容量瓶中;
重复提取一次，过滤，洗涤滤纸，取药渣，水浴80 0C以下蒸干，加2的盐酸45m1，沸水浴提取1h充分放冷，过滤于100m1容量瓶中;重复提取一次，过滤，洗涤滤纸，定容至刻度。精密量取供试液2.0ml，置于25m1容量瓶中，用2 HCl稀释至刻度，混匀；精密取1.0 ml稀释液，精密加入显色剂5.0ml，
混匀。另取2 HCl 1.0ml，加入显色剂5.0ml，同法操作，作为空白对照，置沸水浴中加热l0min，冷却至室温，于625nm处测定吸收度。由回归方程计算粗多糖含量。
标准曲线的绘制
精密吸取对照品溶液2.5, 2.5, 5.0, 7.5, l0.0ml分别置于50, 10, 10, 10,10ml容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至刻度，分别得10, 50, 100, 150, 200μg/ml的试液。再分别精密取上述各浓度的对照品溶液1.0ml，分别精密加入显色剂5. 0m1混匀；另精密取蒸馏水1.0ml，同法操作为空白对照，然后沸水浴加热l0min，冷却至室温，于625nm处测定吸收度。以吸收度为横坐标，葡萄糖的浓度为纵坐标，作图，得标准曲线。
4.2总皂苷的测定
取桔梗根粗粉约0.8g精密称重，置小型索氏提取器中，以乙醚回流提取2h弃去醚液；残渣低温挥尽乙醚，再加16倍量甲醇，超声提取2次，每次3min,滤过，合并两次滤液，水浴浓缩，甲醇定容至25mL容量瓶备用。对照品溶液的配制：精密称取桔梗皂普D标准品约3mg,甲醇溶解定容于1ml备用。取标准品溶液、样品溶液各2 0μL置10mL具塞磨口试管中，热风挥干溶剂，精密加入10香草醛试液0.5ml 和60硫酸5ml,摇匀,60℃水浴加热15min,冰水浴中冷却3min, 在478rnn下测定其吸光值。
4.3桔梗皂苷D测定方法
将收获的桔梗根粉碎，过60目筛，精确称取0. 5 g桔梗根细粉于具塞锥形瓶中，加入25 mL 50甲醇，密塞，称定重量，超声提取1h，放冷，再称定质量，用50甲醇补足质量，摇匀，滤过，滤液用微孔滤膜(0. 45μm)滤过，即得。实验仪器为LC-20AT岛津高效液相色谱仪；色谱条件：Diamonsil C18A (4. 6 mm x 250mm，5 μm)，流动相为乙睛-水（2476），检测波长210 nm，流速0. 8 mLmin-1，柱温35℃。
技术路线
见附件
可行性分析
（1）试验材料、实验室条件、仪器设备、试剂等客观条件
中药教学实验中心的栽培实验室设施完备，通过栽培及对各组实验苗按比例喷施不同浓度与配比的营养液来获取本实验需要的桔梗各生长阶段根；培养皿、高液相色谱仪、总氮测定仪等必备的仪器设施齐全；各类药品、试剂均可直接从实验室获取。
（2）主观条件：
本人是中药专业学生，又学过无机化学、有机化学、生物化学以及植物生理学等课程，有一定的理论基础支撑；同时也做过相关的课程实验，仪器使用熟练，动手能力较强；在实验开始之前，阅读过大量的相关文献，制定了完备、可靠的实验方案，因此准备工作相当充足。
综上所述，本实验可行。
4. 研究创新点
特色或创新之处
目前，桔梗种植较为广泛，不仅可做药用，还可作为食材。但是桔梗研究多集中在桔梗成分、药理等方面，在栽培方面，钼元素与不同形态的氮肥协作对桔梗影响的研究较少。本项目通过分析喷施不同形态氮和钼配比的营养液后，桔梗叶中硝酸盐含量以及根中蛋白质、皂苷D的含量变化，来研究不同形态氮下钼对桔梗生长、产量和品质的影响，不仅可为桔梗的扩大生产及提高药用质量提供理论依据，在食品安全方面也有重大意义。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
本研究预期在12个月内完成：2015年3月2016年5月
2015.32015.4 ：进行前期工作，查找文献资料，完成研究方案的设计。
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