1. 研究目的与意义
本毕业设计的课题涉及到南京格亚有限公司的保密项目，项目代号为AB704P，本课题研究的内容是4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶的含量测定及方法学验证。含量测定采用高效液相外标法测定，方法学验证的内容：系统适用性要求主成分与杂质的分离度应大于1.5,；连续进样5针系统适用性溶液，其峰面积的RSD 2%，保留时间的RSD 1%；线性/范围要求主成分浓度与峰面积作线性回归，相关系数（R） 0.998， ，响应因子RSD 2.0%；精密度包括重复性和中间精密度，重复性要求n=6，RSD 2.0%，中间精密度要求分别考察单人6份样品和两人12份样品测定含量的RSD值，同重复性；溶液稳定性要求与初始值比较，RSD同重复性要求；耐用性试验要求分离度同系统适用性要求，测定数据与方法条件未变化时的测定值比较，RSD同重复性要求。
4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶是枸橼酸托法替布的原料药之一。枸橼酸托法替布是一种治疗类风湿性关节炎的新型重磅药物，类风湿关节炎（RA）是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。虽然枸橼酸托法替布在很多国家已经上市，但是这一类药物国内国外的研究比较少，相关文献也很少，所以可研究性极大。通过对4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶进行含量测定及方法学验证，确定该测定方法可用于该物料含量的检测，保证测定的准确性，为枸橼酸托法替布的合成提供优质的起始物料，进一步确保API的质量。2. 文献综述
4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶含量测定及方法学验证
徐佳怡
南京中医药大学
摘 要：本文主要概述了4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶含量测定及方法学验证这一课题的主要研究内容以及相关的一些知识延伸。目前国内外对于这方面的研究暂无，能找的相关文献屈指可数。关于4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶含量测定及方法学验证的研究，主要采用高效液相色谱法来进行试验，使用常用的反相色谱柱，即十八烷基硅烷（C18），可以有效控制拖尾峰。
关键字：含量、方法学验证、高效液相
Abstract: Thispaper mainly summarizes the main research contents and related knowledgeextension of the determination of 4-chloro-7-toluenesulfonyl-7H-pyrrole[2,3-D]pyrimidine and its methodological verification. At present, there is noresearch on this aspect at home and abroad, and there are only a handful ofrelevant literatures that can be found. The study on the determination andmethod validation of 4-chloro-7-toluenesulfonyl-7H-pyrrole [2,3-D]pyrimidine ismainly carried out by high performance liquid chromatography using a commonlyused reversed-phase column. That is, octadecylsilane (C18) can effectivelycontrol the tailing peak.
Keywords: content，methodvalidation, high performance liquid phase
1.课题来源及研究的目的和意义
1.1.目的
类风湿关节炎（RA）是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。40~60岁的女性为多发群体，在我国，类风湿关节炎的发病率为500万人，若不能得到及时的正规的治疗，约有75%患者将会在3年内出现残疾[1]。治疗类风湿性关节炎的一种新型重磅药物枸橼酸托法替布（(3R,4R)-4-甲基-3-(甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-β-氧代-1-哌啶丙腈枸橼酸盐），它以细胞内信号转导通路为靶点，直接作用于细胞因子的核心部分。托法替布枸橼酸盐是辉瑞公司研发的 JAK3 抑制剂，2012 年 11 月经 FDA 批准上市[2]。枸橼酸托法替布的原料药之一4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶的含量测定及方法学研究就是本课题研究的内容。
1.2.意义
本课题是为了验证测定方法的准确性，是否符合可接受标准，准确控制产品质量。本实验采用高效液相外标法（HPLC）对4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶含量测定进行研究，为质量控制提供快速、有效的分析方法，并针对其系统适应性、线性/范围、精密度、溶液稳定性、耐用性进行试验[3]。
2.国内外在该方向的研究现状及分析
2.1.现状
目前国内对这方面的研究还是比较少的，方法也是比较单一，并没有什么实质性的改进。制药企业的核心竞争力来源于优越的产品力，增加研发投入，推进具备自主知识产权新药的研发工作[4]。国内常用含量的测定方法为高效液相，与枸橼酸托法替布相关的物质的质量控制方法国外还未见文献报告[5]。
2.2.分析
4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶作为新型抗类风湿性关节炎的药物枸橼酸托法替布的原料药物之一，国内对于这一药物还在研究阶段，目前还没有全面的文献对它进行评估。南京格亚有限公司作为一家制药公司，也是在不断的进行研究，所以选择这一课题还是具有些许挑战性的。
3.主要研究内容及创新点
3.1.内容
4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶的含量测定方法学验证。含量测定包括仪器与试剂的选择、选择的色谱条件、溶液配制、测定方法、标准限度。方法验证包括检测波长选择、系统适用性、线性范围、溶液稳定性、精密度、耐用性试验等。
3.2.创新
采用容量法进行测定时，4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶无明显突跃点，故采用高效液相外标法对本品进行定量测定。近年来，高效液相-串联质谱法的研究越来越多[6]，但是成本太高，而高效液相外标法，成本低、灵敏度高、分离度好、专属性高，但是存在前处理复杂，对操作者要求高的缺点[7]。
4.研究方案
4.1.含量
首先，完成仪器与试剂的选择，仪器选择安捷伦1260高效液相色谱仪，试剂为0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液[8]。色谱条件的确定，色谱柱为Ultimate XB-C18 4.6mm 250mm,5 ，流动相为0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测波长234nm，流速1.0ml/min，柱温45℃，进样量5 。采用HPLC外标法测定含量。计算公式为：
4.2.方法学验证
首先对照品、供试品及试剂的确认，仪器的确认，根据药典确定所验证的项目需要符合的可接受标准。然后采用高效液相，自制适合的流动相等试液验证系统适用性，线性/范围，精密度，溶液稳定性，耐用性[9]。选择使用常用的反相色谱柱，即十八烷基硅烷（C18），可以有效减少拖尾。反相液相色谱（RPLC）用烷基键合的二氧化硅固定相已成为一种方法用于分离和分析各种化合物制药，化工，环保等行业许多其他领域[10]。
项目 | 可接受标准 | |
系统适用性 | 主成分与杂质的分离度应大于1.5,；连续进样5针系统适用性溶液，其峰面积的RSD 2%，保留时间的RSD 1%。 | |
线性/范围 | 主成分浓度与峰面积作线性回归，相关系数（R） 0.998， ，响应因子RSD 2.0%。 | |
精密度 | 重复性 | n=6，RSD 2.0% |
中间精密度 | 分别考察单人6份样品和两人12份样品测定含量的RSD值，同重复性。 | |
溶液稳定性 | 与初始值比较，RSD同重复性要求。 | |
耐用性试验 | 分离度同系统适用性要求，测定数据与方法条件未变化时的测定值比较，RSD同重复性要求。 |
表1 验证项目及可接受标准
表1
参考文献
[1] 张春华.甲氨蝶呤与来氟米特治疗类风湿性关节炎的临床疗效和安全性研究[J].重庆医学，2015,44（4）：511-513.
[2] 刘帅，唐超，隋强，吴茂诚，钟静芬.托法替布枸橼酸盐有关物质的合成[J].中国医药工业杂志，2017,48（3）：382-386
[3] 金慧，马燕.氢溴酸沃替西汀原料药HPLC含量测定的方法学研究[J].临床合理用药，2017，10（2A）：73-75.
[4] 叶波，唐建民.国内制药行业发展现状与对应策略[J].中国中医药现代远程教育，2012,10（11）：133-134.
[5] 孙丽娇，吕明明，高爽，孙晓阳，陈明明，陈晓辉.RP-HPLC法测定枸橼酸托法替尼含量及有关物质[N].沈阳药科大学学报，2018,35（2）：131-137.
[6] LI Yu-jiao,LI Qing,MA Jing,CHENQian-qian,BI Kai-shun.Validation of HPLC method for the determination polydatinin giant knotweed rhizome[N].药学学报，2013,48（4）：536-540.
[7] 唐德智.HPLC法测定复方黄芩片中6个成分的含量[J].药物分析杂志，2016,36（10）：1870-1874.
[8] Stith C. Hussian MD.Detrminationof mifepristone levels in wild canid serum using liquid chromatography [J].JChromatography B,2003,794(1):9-15.
[9] 邹干朋，刘光斌，高颖，张宇博，姜芳宁.HPLC外标法快速测定苯妥英血药浓度[J].海峡药学，2015,27（11）：250-252.
[10] GUO Zing-Qing,CHEN Lei,WANQian-Hong.Endcapping of Octadecyl Bonded Silica by Atomic Layer Deposition forSeparation of Basic Compounds[J].Chin J Anal Chem,2009,37(11),1572-1576.
3. 设计方案和技术路线
本课题主要分为两个部分，4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶的含量测定和其含量测定的方法学研究。研究方案如下：
1. 含量
采用HPLC外标法测定含量。
4. 工作计划
确定了含量测定所需要的仪器和试剂、色谱条件。色谱柱规格：Ultimate XB-C18 4.6mm 250mm,5 。流动相：10mM磷酸二氢钾溶液（pH6.80）-乙腈（60:40）。检测波长为234nm。通过紫外分光光度计检测发现，4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶在234nm波长处有最大吸收，所以也确定了含量检测的波长为234nm。
确认了对照品、供试品及试剂的来源、批号、制备条件和储存情况以及方法学验证的可接受标准。实验前的准备工作基本已经完成，再次检查之后，下一步就可以直接配样测定，整理实验数据，撰写毕业论文。
5. 难点与创新点
采用电位滴定法测定4-氯-7-甲苯磺酰基-7H-吡咯[2,3-D]嘧啶的含量时，本品并没有明显的突跃点，所以采用高效液相色谱法对本品进行含量测定。
本法专属性强，准确度高，操作简单。
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