1. 研究目的与意义(文献综述包含参考文献)
摘要:基于PCR介导的基因敲除原理,采用Cre-LoxP敲除系统,对酿酒酵母细胞中ATP合酶d亚基进行敲除,构建ATP合酶d亚基缺陷型酿酒酵母模型,为酿酒酵母其他基因的敲除提供了可借鉴的方法。
关键词:酿酒酵母;基因敲除;Cre-LoxP敲除系统;ATP合酶亚基缺陷线粒体ATP合酶是线粒体氧化磷酸化的关键酶,其功能缺陷会导致能量代谢障碍相关的线粒体疾病。
线粒体ATP合酶是由多个亚基组成的蛋白复合物,其生物合成和组装是个复杂的生物过程。
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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
1. Loxp敲除系统的引物设计:引物 R1、 R2是依据酿酒酵母 ATP合酶线粒体核基因和质粒中LoxP-Kan-LoxP设计的. R1、R2的 5端分别有与酵母基因组ATP基因起始密码子(包括)前和终止密码子 (包括)后相同的4个碱基用来进行同源重组. R1 ( R2) 的 3′端有19 ( 22) 个碱基与质粒中 LoxP-Kan-LoxP两 侧的上游(下游)某段序列相同用来扩增 LoxP-Kan-LoxP。
2.Cre-Loxp敲除DNA的PCR构建:以R1、R2为上下游引物,质粒为模板进PCR扩增,获得扩增产物 R1-R2.PCR标准扩增反应程序为: 94 ℃热启动5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min共30个循环,最后72℃延伸10min。
取3μL PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证。
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