1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
水通道蛋白（AQP）是属于MIP超家族的一种膜内在蛋白，是细胞间和细胞内水分快速运输的主要通道，在调节植物细胞内水分和渗透平衡起着至关重要的作用[1]，AQP是个家族基因，在拟南芥中发现35种，玉米有31种[2]，为典型的高水分选择性通道蛋白，其不仅影响根、叶、种子以及花朵的水分运输，也与植物矿物、碳、氮定位有关[2]。AQP是一类丰富而多样的蛋白质家族[3]，因此研究水通道蛋白的表达水平及细胞定位可以阐释其多重的生理作用[4]。水通道蛋白对水分及其他小分子如植物体内的H2O2的转运至关重要[5,6]。水通道蛋白能够诱导植物的抗病和耐旱，有推测是因为防卫信号从质外体想细胞质转导[7] 。
有关研究表明，门控机制能够调节水通道蛋白的运输，而一些因子会影响门控机制，如磷酸化、pH、Ca2 、压力、温度等[8]。1994年Daniels等将rd28的cRNA注入爪蟾卵母细胞中，发现RD28的表达使得卵母细胞中水的通透性升高了10到15倍，表明了RD28在卵母细胞的质膜上形成了水分运输的通道。因此证实了RD28也是一类水通道蛋白[9]。水通道蛋白分布广泛且种类丰富，单子叶、双子叶以及C3、C4代谢产物中普遍分布着水通道蛋白，并根据氨基酸序列的同源性分析，从蛋白质数据库中发现了大量的水通道蛋白的同源物[10]。依据水通道蛋白在细胞膜的定位及氨基酸序列的同源性可以划为5类：质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic protein, PIP)、液胞膜内在蛋白(tonoplast intrinsic protein, TIP)、类Nod26膜内在蛋白(nudolin 26-like intrinsic protein, NIP)和小分子碱性膜内在蛋白(small basic intrinsic protein, SIP)以及XIP (Xintrinsic proteins, the recently identified uncharacterized intrinsic proteins)，拟南芥体内含有35种MIP类似蛋白，其中包括13种属于PIP或类似蛋白、10种TIP或类似蛋白。球蒴藓Sphaerotheciella sphaerocarpa基因组中除具有PIPs，TIPs，NIPs，SIPs和XIPs等5类AQP外，还具有HIP (hybrid intrinsic proteins)和类GlpF (glycerol facilitator)膜内在蛋白(GlpF-like intrinsic proteins，GIPs)两个新类别[11]。PIPs虽然通常定位于质膜，但有时也会移动到其他部位Kammerloher等1994年从拟南芥的cDNA文库中筛选出了5种PIP (plasma membrane intrinsic proteins)，PIPs普遍分布于植物的根、茎、叶及果实的质膜上，拟南芥中有13类PIPs，根据其氨基酸序列的同源性，可以分为PIP1，PIP2两类[12]。PIP1又分为PIP1a，PIP1b，PIP1c；PIP2又分为PIP2a，PIP2b[13]。许多研究证明，PIPs在水的转运过程中起到关键的作用[14]。PIP1主要存在于内质网上(ER)，PIPl单独表达时，没有透水性或透水性很低。在爪蟾卵(Xenopus oocytes)中，PIP1要正确定位到质膜(PM)上，必需要PIP1和PIP2的共表达[15]。
TIPs有α-TIP, β-TIP, γ-TIP, δ-TIP和ε-TIP等5个亚类，1996年，Daniels等在拟南芥中发现了另一种新的水通道蛋白δ-TIP，其分布于茎的维管束的营养体液泡膜中[16]。NIPs存在于共生根瘤类菌体和豆科植物的共生膜上[17]。依据水通道蛋白中心渠道的选择性过滤器(ar/R区域)的芳香族氨基酸和精氨酸的氨基酸序列，可将NIPs分为NIPⅠ、NIPⅡ两类[18]。
2. 研究的基本内容和问题
1.目标：水通道蛋白AQP在调节植物细胞内水分和渗透平衡起着至关重要的作用，水通道蛋白是属于MIP超家族的一类主要内在蛋白，几乎存在于所有的生物体内。水通道蛋白调控细胞和细胞间以及细胞内大部分的水分运输。根据其亚细胞定位、氨基酸序列的同源性及结构特征可将水通道蛋白分为五类：质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)，液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs)，类Nod26膜内在蛋白(nodxilin 26-like intrinsic proteins, NIPs)，小分子碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins, SIPs)，XIPs (Xintrinsic proteins, the recently identified uncharacterized intrinsic proteins)。AQP是一类丰富而多样的蛋白质家族，因此研究水通道蛋白的表达水平及细胞定位可以阐释其多重的生理作用。水通道蛋白对水分及其他小分子如植物体内的H2O2的转运至关重要。水通道蛋白能够诱导植物的抗病和耐旱，有推测是因为防卫信号从质外体想细胞质转导。
2.内容;PIPs普遍分布于植物的根、茎、叶及果实的质膜上，拟南芥中有13类PIPs，根据其氨基酸序列的同源性，可以分为PIP1，PIP2两类。PIP1又分为PIP1a，PIP1b，PIP1c；PIP2又分为PIP2a，PIP2b 。许多研究证明，PIPs在水的转运过程中起到关键的作用。PIP1主要存在于内质网上(ER)，PIPl单独表达时，没有透水性或透水性很低。在爪蟾卵(Xenopus oocytes)中，PIP1要正确定位到质膜(PM)上，必需要PIP1和PIP2的共表达。
3.拟解决的关键问题：目前对植物水通道蛋白的一些成员的研究比较清楚，但关于PIP1;4的功能研究不多。AtPIP1;4在植物的抗病过程中，起到何种作用及其作用机制都还不甚清楚。为了研究AtPIP1;4对植物抗病性的影响，我们将AtPIP1;4片段转入拟南芥Col-0中，获得了AtPIP1;4过表达植株，选用了拟南芥atpip1;4突变体CS879846纯和植株。在接种了Pst DC3000后，观察并验证表达植株发病程度不与WT发病轻重；来验证AtPIP1;4在拟南芥抗病反应中是否起一定的作用。
3. 研究的方法与方案
1.研究方法及技术路线： 目前对于AtPIP1;4的功能研究功能不多，为了研究AtPIP1;4在拟南芥对DC3000抗病性中的影响，我们将PIP1;4基因转入拟南芥Col-0中，获得了PIP1;4过表达株系。
转基因拟南芥AtPIP;4过表达植株的获得：将转入1301- AtPIP1；4-eGFP-GST表达载体的农杆菌在含有利福平和卡那抗性的固体培养基上划线，培养过夜，收集菌体，侵染花序，在适宜的条件下培养，收种后用于后续的纯合体筛选。
转基因拟南芥PIP1;4过表达纯合株系的筛选：用菌液浸泡拟南芥Col-0花序后直接获得的种子为T0，将种子撒播在含有潮霉素的MS培养基平板上，放入光照培养箱中观察苗子的生长情况。将植株正常生长、根系发达且有根毛。2周左右能长出4片子叶的幼苗移入新的无抗性的培养基中，2周后移栽在盆钵中，收获的种子为T1代。将T1代种子撒播在含有潮霉素的MS培养基平板上，约3:1的分离比，移栽阳性植株，单株收种，收获得种子为T2代。如上所述筛选T2代种子，不出现分离比的株系即是纯系。
4. 研究创新点
创新之处：
1. 成功地将AtPIP1;4片段转入拟南芥Col-0植株中，并通过抗性筛选和分子验证，得到过表达纯合植株；此外，还通过三引物法，鉴定出了atpip1;4突变体纯合植株。
2. 用southern blot 法验证拟南芥片段的长度。国内外尚无此项的报告。
5. 研究计划与进展
研究进展：1. 2014年4-6月成功地将AtPIP1;4片段转入拟南芥Col-0植株中，并通过抗性筛选和分子验证，得到过表达纯合植株；
2. 2014年9月对PIP1;4过表达植株和atpip1;4突变体植株接种Pst DC3000后，发现AtPIP1;4在植株中的表达量与植株抗病性呈正相关。
3.2014年10月通过三引物法（LB、LP、RP)鉴定出了atpip1;4突变体纯合植株。
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