大豆突变体子叶折叠性状的初步定位开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

（一）课题的意义：

大豆（Glycine max（L.）Merr）是重要的粮食和经济作物，种植广泛。子叶是种子胚的组成部分之，大豆子叶的作用主要是在植株营养生长阶段供给幼苗养分。在无胚乳的种子内，子叶特别肥厚，贮藏着大量的营养物质，在有胚乳的种子内，子叶不发达，但它可从胚乳中吸收养料，供胚发育需要；另外子叶还能够提高幼苗对病害虫以及各种不良环境的抗性，从而影响产量。本研究以子叶折叠突变体为实验材料， 期望找到控制子叶发育的基因。

（二）国内外研究概况：

一：大豆子叶研究进展

在黄瓜子叶的研究方面，王慧哲等人以黄色子叶突变体B180H为母本,颜色正常子叶黄瓜Q12为父本,构建F₁、F₂、BC₁群体,并通过对6世代子叶叶色表型的观察和遗传分析,发现，黄瓜黄色子叶性状是由1对核基因控制的,绿色子叶相对于黄色为完全显性。

在水果猕猴桃研究上，周艳玲等人通过辐射诱变"和平一号"美味猕猴桃获得三子叶突变体植株,并对猕猴桃三子叶植株的形态特征如单叶长、单叶宽以及叶片气孔分布和表面毛状体等进行观察分析，发现三子叶植株叶表面的毛状体比双子叶猕猴桃植株更加浓密,这些结果为三子叶猕猴桃育种利用打下基础。

在油菜突变体的研究中也对子叶进行了分析，魏慧敏等人以发育10 d的黄化油菜突变体为材料,分析了突变体油菜子叶类囊体膜的色素含量、室温吸收光谱、叶绿素荧光发射和激发光谱以及蛋白内源荧光光谱的变化。突变体油菜子叶类囊体膜的蛋白内源荧光也明显异于野生型,进一步表明突变体油菜子叶类囊体膜蛋白组成发生了改变。

在大豆子叶互生突变的研究中，丁德荣等人将大豆品种N8855种子浸种后播于消毒土的盆钵内，置于无光照的生长箱内，生长温度为29℃，于第8天发现-株突变体(M₀)子叶表现互生现象，而其余植株子叶表现对生。此株子叶互生突变体(M₀)的M1株系置光照培养箱中生长，同N8855一样表现子叶对生；而经暗室诱导子叶表现互生，植株其余性状同于N8855。M₂代表现同M₁一致。这种经暗诱导表现子叶互生现象在双子叶植物上是首例报道。

二、基因定位

2.1基因定位分类

分为两类：主基因定位和QTL定位。主基因，是一类控制质量性状的基因，其性状表现为不连续的变异。微效基因，是一类控制数量性状的基因，因此通常称为数量性状座位（quantitative trait locus，QTL），其性状表现为连续的变异。

2.1.1主基因

是一类控制质量性状的基因，其性状表现为不连续的变异。

2.2主基因的概念

分子标记是通过它们产生的带型来识别的，而基因是通过它们产生的表现型来识别的。因此基因定位既要分析分子标记的带型，又要分析基因型产生的表现型。基因定位的基本原理是通过分析分子标记与表现型之间的连锁关系，确定基因在遗传图谱中的位置。陈涛等通过表型分析发现农农艺性状差异不明显，遗传分析发现该突变性状受一对隐性核基因控制，将突变基因定位在水稻第2染色体长臂上，最后将该基因命名为gra(t)。

2.3 主基因表型鉴定要求

在基因定位中，目的基因的基因型是通过它的表现型来确定的，因此表现型测定是决定基因定位质量的关键。表型测定要求：（1）由于作图群体较大，表型分析通常在自然条件下进行，必须使作图群体生长正常，并且应减少个体间的试验误差；（2）应以双亲和F₁为对照，并统一标准；（3）表型测量要准确。表型在测量和辨别过程中通常容易出现误差，必须统一测量标准，并由熟练的人员操作；（4）必须采取基因专一性的检测方法，如特定的菌种、花粉育性等。

2.4 微效基因

是一类控制数量性状的基因，因此通常称为数量性状座位（quantitative trait locus，QTL），其性状表现为连续的变异。由于这类基因控制数量性状，并且表现为微小效应，因此难以用主基因定位的方法来定位。随着分子标记技术的不断发展，QTL定位的方法也日趋成熟。

是一类控制数量性状的基因，因此通常称为数量性状座位（quantitative trait locus，QTL），其性状表现为连续的变异。由于这类基因控制数量性状，并且表现为微小效应，因此难以用主基因定位的方法来定位。随着分子标记技术的不断发展，QTL定位的方法也日趋成熟。

2.5 QTL定位方法

(1) 单标记分析 (2) 区间作图法

(3) 复合区间作图法 (4) QTL定位的混合线性模型方法

2.6 QTL分析的发展方向

把复杂性状变为简单性状；把多基因分解为单基因（单一孟德尔因子）； 把数量性状变成质量性状。

(1) 作图群体的限制 (2) 环境条件的干扰

(3) 遗传图谱的饱和度 (4) 大豆导入系的发展

2.7解决方法

(1)要想提高定位的精确度及稳定性，首先要选择目标性状差异较大的亲本组合进行QTL定位研究，合适的群体量能够提高定位准确性；其次要控制环境条件的影响，减少遗传背景对定位的干扰。

(2)解决环境干扰的方法是发展永久性分离群体并经过多年多点的 QTL检测进行定位分析，以提高检测的真实性和稳定性。另外，由于某些数量性状的变化是动态的，而QTL定位研究主要是针对某个时期静态的性状表现，因此QTL定位研究应该向动态分析转化。

(3)构建高密度的大豆遗传连锁图谱对于QTL定位研究是十分必要的，应该不断发展新的作图群体，增加遗传图谱的密度，为 QTL定位的精确性奠定基础。

三、分子标记辅助选择

3.1 分子标记辅助选择的原理

基因定位的目的是为了更好地利用基因。分子标记辅助选择技术是将上述分子标记应用于作物育种或改良的一种手段。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或共分离的分子标记对选择个体进行目标基因以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，以获得所需的个体，达到提高育种效率的目的。

3.2 标记与基因的关系

在分子标记辅助选择中，直接选择的是分子标记的基因型，而不是目的基因的基因型，因此利用分子标记选择目的基因的基因型，只是起辅助选择的作用。当分子标记与目的基因紧密连锁时，通过选择分子标记的基因型，可以有效地选择到目的基因的基因型。但当分子标记与目的基因之间的距离较远时，通过分子标记的基因型选择目的基因的基因型的效果就变得较差。分子标记辅助选择的效果取决于连锁的紧密程度。

3.3 分子标记分类

主要有两类，即RFLP标记和以PCR为基础的分子标记。过去用得较多的是RFLP标记，但RFLP标记在技术上比较复杂，在育种中难以利用。以PCR为基础的分子标记，如STS和SSR等，主要利用的是PCR技术，具有方法简单、时间短、费用少的优点，适合育种上的要求。因此，建立以PCR为基础的分子标记辅助选择的技术体系，将使分子标记辅助选择技术得到切实可行的利用。

把RFLP标记转变为以PCR为基础的分子标记，就是把RFLP标记转变为序列标签位点(Sequence tagged site，STS)标记。这个过程包括：（1）对RFLP标记（ 长度约为0.5-2.5kb）进行末端测序，测序的末端长度通常为100bp-300bp。（2）利用测序的末端序列设计PCR引物，PCR引物设计的原则与前述的相同。

3）利用上述设计的PCR引物进行PCR扩增，扩增的产物即为STS标记。STS标记与原RFLP标记具有相同的座位，其片段长度比RFLP标记的长度略短。 利用STS引物扩增产生的扩增片段长度多态性称为扩增子长度多态性(ALP)。与RFLP相比，ALP的频率明显降低。

四、基因的初步定位

4.1初步定位的含义

目的基因的初步定位(mapping the target gene)是利用分子标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体的一定区段内。

4.2初步定位的分类

初定位通常使用近等基因系法( NILs)或群体分离分析法( BSA)

4.2.1近等基因系

是指只有目标性状基因有差异，其它性状基因相同的2个群体，可以通过连续回交的途径获得。如王春连等通过杂交、回交、自交等手段培育近等基因系至BC4F．在此基础上继续通过杂交转育手段培育至BC6F代。经田间农艺性状考查，结果表明除了抗病性外其它农艺性状均与感病轮回亲本金刚30相同，得到稳定的携有Xa30(t)的近等基因系，命名为CBB30。最近，魏金鹏等对大豆成熟期近等基因系导入片段进行分析，SSR标记结果表明，利用近等基因系不仅验证了已知E_l基因所在的染色体区间，发现了1个新的标记位点与E_l相关，而且还鉴定出了一些基因相关的标记，明确了轮回亲本中成熟期基因所在导入片段的大小及位置，为成熟期基因的精细定位和克隆提供了信息。近等性的好坏与双亲的遗传差异、基因的连锁、采用的方法、回交代数、鉴定环境等均有很大关系。随着分子标记辅助技术的普遍应用，利用目标性状基因与分子标记之间韵紧密连锁关系 进行分子标记辅助选择，即对目标性状在分子水平上进行选择，构建的近等基因系结果可靠、简便快捷。

4.2.2群组分离分析法

由于近等基因系需要连续的回交，所需的时间较长，因此Michelme等提出了群组分离分析法（BSA法)，将分离群体中研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病)分成2组，将每组内一定数量的植株DNA 等量混合，形成两个池，这两个池仅在目标性状(如抗病性)上有差异。利用分子标记技术寻找两个池的扩增谱带的差异，这种多态性极可能与目标基因连锁。再用所有的分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离的确定。汪维红等人通过构建紫色和绿色池，对分布在白菜基因组10个连锁群上的125个InDel 标记和100个SSR标记进行多态筛选，发现连锁现象，为进一步精细定位和克隆put基因奠定了基础。

（三）应用前景：

前人的研究结果表明，与对照材料相比，子叶折叠突变体蛋白质和氨基酸含量明显提高，这说明控制子叶折叠的基因可能与控制蛋白质和氨基酸含量的基因存在关联。因此，对该突变体的基因定位对大豆子叶发育的分子遗传学研究奠定基础。为后续大豆品质相关基因的研究也有一定的参考作用。

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