1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
过去20年的研究结果显示,水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae,Xoo)中的avr基因和决定其毒性变异的遗传学基础主要是arvBs3/pthA基因家族。由于该家族基因产物通过Ⅲ型分泌系统(T3SS)进入植物细胞核,起转录因子(transcription activator-like,tal)作用,激活寄主的感病基因或抗性基因表达。Tale是由一个中央DNA结合区、一个核定位信号和两侧的N-末端的分泌信号及C-末端的转录激活域序列组成。其中的脱氧核糖核酸结合区域包括33 - 34个氨基酸的多个重复,每个重复中的第12-13个氨基酸是高度变异的,两个氨基酸组成一个RVD(repeat variable di-residue),RVD组成、顺序决定与目标核苷酸序列的识别或结合。由于Tale基因的高度同源,必须通过测序和序列分析才能明确细菌中Tale的组成,进而研究Tale基因的互作靶标。
已知Xoo通过III型分泌系统向寄主分泌转录激活因子TALE,当效应因子激活寄主抗病基因表达时产生非亲和互作,当激活寄主感病基因表达时,产生毒性,促进病害发生。其中得到匹配鉴定的TALE和抗病基因对应avrXa27-Xa27,avrXa10-Xa10 avrXa7-Xa7。其他Xoo中鉴定的tal基因靶标,如Hen1等在病原-植物互作中也得到极大的关注。目前得到科学界最大的关注的是,tal基因识别的水稻感病基因在抗病育种中的作用。这类感病基因多数为水稻中的膜蛋白SWEET,在运输光合作用产物中具有重要作用,与植物衰老、植物的抗逆反应及植物的生长发育等许多方面起重要作用。Xoo利用tal挟持寄主糖转运蛋白SWEET基因的启动子,诱导SWEET基因表达,促使水稻细胞中的蔗糖流入非原质体空间,细菌从而获得蔗糖养分,得以生殖和扩展。目前在水稻中已发现5个clad III SWEET组的OsSWEETs与蔗糖运输有关,分别是OsSWEET11(xa13)、 OsSWEET12、OsSWEET13(xa25)、 OsSWEET14和 OsSWEET15。Xoo中已鉴定PthXo1特异性识别OsSWEET11(xa13),PthXo2 识别OsSWEET13(xa25),而有多个菌株通过激活OsSWEET14的表达来促进病害发生。通过TALEN或CRISPR基因编辑技术修饰这些靶标基因的启动区被Tale基因识别的区域结果导致抗病植株的产生。这进而促使科学家去利用Xoo菌株中Tale基因的组成和特异性识别来开拓新的抗病育种途径。即可以把多个菌株中的TALE识别的核酸序列串联组成来驱动抗病执行基因如Xa10,Xa27以及Xa23等可以获得同时对白叶枯和细菌性条斑菌的广谱抗性。Adam等通过大规模的基因组测序发现Xoc菌株中可能存在5个保守的TAL组成,这对通过上述途径培育抗细菌性条斑病菌水稻提供了捷径。
已知Xoo和Xoc两种细菌生物学和生理生化特性、致病因子及与植物互作的分子机制相似,但对水稻的侵入途径及侵入后的扩展行为完全不同,Xoo主要从水孔侵入,而Xoc主要从气孔侵入。另外在Xoc菌株中有比Xoo菌株中更多tal基因,但并没有发现Xoc诱导任何SWEET基因表达。那么Xoc中Tale基因的功能在病害发生中具有多大的贡献呢?
2. 研究的基本内容和问题
研究目标:鉴定Xoc GD41 Tale基因组成
研究内容:
在已建立的Xoc GD41的基因组文库中,筛选出含有Tale基因的所有阳性克隆。
3. 研究的方法与方案
研究方法:
1.PCR扩增技术
是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力,能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品,因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点,已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。
4. 研究创新点
水稻白叶枯病菌(Xoo)里面的Tale基因部分功能已得到研究,其中部分基因决定细菌-水稻互作的亲和性,以及其他互作靶标。但水稻细菌性条斑病菌(Xoc)中Tale基因功能的研究还非常少。我们首先建立了Xoc GD41的基因组文库,在此基因库基础上筛选出含有Tale基因的所有阳性克隆,为进一步通过测序鉴定Xoc GD41基因组成及其靶标基因打下基础。
5. 研究计划与进展
研究计划:
1.利用1个月的时间,大量对Xoc GD41基因组文库进行初步阳性克隆筛选。筛选克隆近2000个。
2.利用4周时间对初步筛选出的阳性克隆提取质粒DNA,并用Sph I进行酶切,电泳后,去除假阳性克隆及重复阳性克隆。
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